花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量調(diào)查

IMCTT

　　導(dǎo)語

　　花生粕(Peanut meal)是以脫殼花生果為原料，經(jīng)提取油脂后得到的副產(chǎn)品。其中蛋白質(zhì)含量達48.68%，多糖含量達32.50%，并含有Mg、K 等多種礦物質(zhì)元素，但氨基酸種類不平衡。隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，魚粉需求量大幅度增加，供應(yīng)量嚴(yán)重不足，用其他蛋白質(zhì)原料替代魚粉成為畜禽及水產(chǎn)飼料營養(yǎng)研究的熱點。我國花生總產(chǎn)量居油料作物首位，但因其易感染黃曲霉毒素，同時含有影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收及代謝的抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要有胰蛋白酶抑制因子(Trypsin inhibitor，TI)和皂苷(Saponin，S)等，限制其在畜禽水產(chǎn)中的應(yīng)用。其中，胰蛋白酶抑制因子可以和小腸中的胰蛋白酶及糜蛋白酶結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使酶失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率和利用率降低，動物生長遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率降低。皂苷則易增加畜禽腸黏膜細(xì)胞的通透性，抑制活性營養(yǎng)的運輸，破壞腸細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與鞣質(zhì)會形成復(fù)合物，毒性增強，還會和鋅離子形成不溶復(fù)合物，降低鋅的吸收率。目前，花生粕中的胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量尚未被調(diào)查，鑒于花生品種、制油工藝、操作條件、設(shè)備、技術(shù)水平的差異，制油之后的花生粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量也不盡相同，因此本文闡述花生粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量范圍，并參照豆粕中皂苷提取方法對花生粕中皂苷提取方法中乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率進行單因素優(yōu)化，從而獲得花生粕中皂苷的最佳的提取方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　酶標(biāo)儀（Power Wave Xs2美國BioTek公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000，上海某生化儀器廠）、高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-400KDE，昆山市某儀器有限公司）、雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器（SPH-2012C，上海某設(shè)備有限公司）、恒溫水浴箱（SB-9，日本EYELA公司）、高速離心機（Hitachi 公司，日本）。胰蛋白酶抑制因子定量檢測試劑盒購自北京某生物工程技術(shù)有限公司，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%）購自上海某科技公司，試驗用水為Millipore 純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制得的高純水，乙醇、冰醋酸、香草醛、高氯酸為分析純。

　　1.2 樣品來源

　　采集來自山東省知名花生油、食品、油脂、飼料及其他企業(yè)的21批次(使用環(huán)節(jié))的花生粕，其中5批次采用浸提法，剩余均為壓榨工藝。

　　1.3 樣品測定方法

　　1.3.1 胰蛋白酶抑制因子的測定

　　ELISA測定參照產(chǎn)品說明書。具體過程如下：將待檢的花生粕粉碎成60目以上顆粒，稱取0.100 g樣品于50 ml離心管中，加入30 ml提取液，于25 ℃振蕩16 h，靜置2 min后，4 000 r/min的速度離心5 min，取上清液用稀釋工作液稀釋300倍。將樣品盒標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)液平行測定兩次，記錄校準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置，經(jīng)過加樣、洗板、加酶標(biāo)試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm雙波下讀取吸光度值。

　　吸光率(%)=B/B0×100。

　　式中：B——校準(zhǔn)品或樣品的平均吸光度值；B0——標(biāo)準(zhǔn)品1的平均吸光度值。

　　校準(zhǔn)曲線的繪制：以校準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.3.2 皂苷的測定方法

　　1.3.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，定容到50 ml，用甲醇（HPLC）配制0.1 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、100、200、300、400 μl及500 μl分別于10 ml離心管中，在50 ℃下氮氣吹干，在試管中加入新配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液（稱取5 g香草醛加入100 ml冰醋酸中充分溶解）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60 ℃水浴上加熱15 min，流水冷卻，加冰醋酸5 ml，混勻，酶標(biāo)儀波長547 nm處測量OD值。以齊墩果酸含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.3.2.2 花生粕中皂苷提取方法的優(yōu)化（見表1）

　　樣品提取參照阮洪生等對豆粕中皂苷提取方法，并在實驗室條件下進行單因素優(yōu)化。對花生中皂苷的超聲時間、提取液濃度（乙醇：水）、料液比、超聲溫度及超聲功率進行單因素試驗優(yōu)化。鑒于前人研究不對提取次數(shù)進行優(yōu)化，提取次數(shù)均為2次。表1為花生粕中皂苷前處理條件的單因素優(yōu)化及結(jié)果。通過對試驗結(jié)果不同處理組進行單因素方差分析，提取方式中超聲1 h與2 h差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于超聲3 h處理組，考慮充分提取選取2 h，若時間有限可選取1 h；提取液體積分?jǐn)?shù)(乙醇：水)為70：30和80：20組的提取率顯著高于90：10處理組，發(fā)現(xiàn)提取液體積分?jǐn)?shù)為80：20時提取率最高；料液比1：25時提取率較低，另外兩組的提取率差異不顯著(P>0.05)，其中料液比為1：20時提取率最高；超聲溫度70 ℃和80 ℃的提取率差異不顯著(P>0.05)，且均顯著高于60 ℃組，其中超聲溫度70 ℃提取率最高。超聲功率70%和80%的提取率顯著高于60%處理組，考慮到超聲功率較高會引起超聲溫度變化，并且超聲功率為70%時皂苷含量高于80%，因此選用70%的超聲功率。最終確定的前處理方法如下：稱取一定質(zhì)量粉碎后的花生粕，按照1：20 的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，超聲浸提2 h，超聲溫度和功率分別為70 ℃和70%。冷卻室溫后4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液后，重復(fù)上述步驟，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5~10 ml，用去離子水定容至25 ml，渦旋混勻，取200 μl提取液加入10 ml離心管中，50 ℃下氮吹，后續(xù)步驟與1.3.2.1氮吹之后的步驟一致。

　　1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

　　采用SPSS 19.0、Excel 2013及酶標(biāo)軟件。

　　2結(jié)果

　　2.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量(見表2)

　　由表2 可知，花生粕中TI 平均含量為（2.41±1.21） mg/g，實測值范圍為0.73~4.88 mg/g，選擇P5（5%的含量小于該值，下同）~P95（95%的含量小于該值，下同）為置信區(qū)間，含量范圍為0.94~4.80 mg/g。其中5 批次經(jīng)浸提工藝的樣品TI 含量范圍為1.27~4.88 mg/g，其余經(jīng)壓榨工藝的樣品TI 含量范圍在0.73~4.80 mg/g內(nèi)，表明壓榨之后TI含量雖最低，但兩種方式的工藝下的TI含量最高水平一致，從而表明TI含量不僅與制油工藝相關(guān)，也可能與花生品質(zhì)、加工參數(shù)相關(guān)。但浸提法下的均值水平[（2.78±1.32）mg/g]高于壓榨方式下的TI均值水平[（ 2.29±1.20）mg/g]，從而表明壓榨法較浸提法能較大程度消除TI。

　　2.2 花生粕中皂苷含量(見表2)

　　由表2 可知，花生粕中皂苷平均含量為（7.20±0.18）mg/g，實測值范圍為5.74~11.43 mg/g，P5~P95 含量范圍為5.78~9.01 mg/g。浸提和壓榨工藝下的花生粕中皂苷含量范圍分別為5.74~7.67 mg/g 和5.78~11.43 mg/g，均值含量分別為(6.63±0.82) mg/g和(7.38±1.38) mg/g，浸提法較壓榨法在含量范圍和均值較低，表明浸提法較壓榨法去除皂苷程度大。

　　2.3 花生粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量比較

　　由表2發(fā)現(xiàn)，皂苷含量整體高于胰蛋白酶抑制因子含量，花生粕中皂苷含量變異水平低于胰蛋白酶抑制因子，說明現(xiàn)在的制油水平的差異對胰蛋白酶抑制因子影響較大。另外，對花生粕中胰蛋白酶抑制因子和皂苷含量進行線性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者之間相關(guān)性不顯著。

　　3討論

　　3.1 花生粕中胰蛋白酶抑制因子結(jié)果分析

　　羅虹等對鮮食花生中的TI進行提取并對其活性進行了測定，活性范圍在0.062%~0.451%之間，與本調(diào)查中花生粕含量范圍接近，表明花生經(jīng)制油后其內(nèi)TI沒有被大量消除，其原因在于花生TI具有極度耐熱性，這與花生TI粗提物經(jīng)100 ℃水浴15 min，殘留活性為對照(25 ℃)的77%；100 ℃水浴1 h，殘留活性為對照的68%研究結(jié)果一致。李素芬等的研究顯示，肉仔雞飼喂TI 含量最高的生大豆組(4.65%TI/CP)胰腺腺管上皮組織具有明顯的增生性變化，細(xì)胞體積增大和數(shù)量稍有增多，并伴有空泡樣變性；隨著TI濃度的下降，胰腺腺管細(xì)胞增生現(xiàn)象也減輕，且日糧中TI/CP在0.2%~1.97%時飼喂仔雞胰腺并未出現(xiàn)明顯變化。而參照花生粕中粗蛋白質(zhì)45%計算，花生粕中TI/CP 在0.2%~1.07%，故不會對肉仔雞產(chǎn)生危害。另外，本研究中花生粕中TI低于豆粕（2.2~61.6 mg/g），也低于發(fā)酵豆粕[（ 7.5±7.6）mg/g]和膨化豆粕[（ 18.3±2.3）mg/g]中的平均水平。

　　3.2 花生粕中皂苷結(jié)果分析

　　由檢測結(jié)果可知，花生粕中皂苷含量低于豆科植物皂苷含量范圍18~41 mg/g，其原因是加工處理過程中皂苷類化合物會降解流失。孫健在加工方法對菜豆中主要皂苷的影響研究中表明：熱處理（高溫烹煮、高壓滅菌）會導(dǎo)致豆中主要皂苷含量顯著流失，同時，皂苷含量<1 g/kg時不會影響主要養(yǎng)殖魚類。根據(jù)本研究結(jié)果，在魚類養(yǎng)殖中建議花生粕使用量不超過17%。劉襄河在飼料中用花生粕替代魚粉比例達28.6%（花生粕添加量為14%）時，不影響凡納濱對蝦的生長性能、飼料利用率及其免疫功能，因此，本研究中花生粕測定范圍為正常范圍。單胃動物對皂苷反應(yīng)不同，雞比其他單胃動物敏感，日糧中皂苷含量為0.15%可降低肉仔雞生產(chǎn)性能及產(chǎn)蛋率。按照本研究花生粕中皂苷含量范圍，不考慮霉菌污染，花生粕使用范圍為19.56%~26.13%。

　　花生粕中皂苷含量（0.578%~0.901%）與大豆餅中皂苷含量水平一致（0.6%~0.9%），高于菜豆莢中皂苷含量（0.097%~0.786%）。苜蓿中含有豐富的皂苷，根部平均含量在1.335%，大于莖(0.596%)和葉(0.655%)中，與花生粕中皂苷平均水平一致，從而表明花生粕中皂苷含量不容小覷。

　　4 結(jié)論

　　本研究采集山東省市售使用環(huán)節(jié)中的21批次花生粕，其中胰蛋白酶抑制因子在0.94~4.80 mg/g含量范圍內(nèi)，含量較低，但不同動物對其耐受性評價有待研究。皂苷含量范圍為5.78~9.01 mg/g，高于胰蛋白酶抑制因子，可能是限制花生粕在飼料中應(yīng)用繼霉菌毒素之后的第二因素。浸提法比壓榨法制油后的花生粕中胰蛋白酶抑制因子含量高，皂苷含量低。這兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量之間相關(guān)性不顯著；同時，花生粕中皂苷含量高于胰蛋白酶抑制因子含量。該研究數(shù)據(jù)將有助于了解現(xiàn)行市場中花生粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量水平，引起飼料企業(yè)、制油企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)對花生粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的重視，為花生粕在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中的合理使用提供指導(dǎo)意義。

　　來源：飼料工業(yè)