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現(xiàn)代動(dòng)物生物化學(xué)
第一講 蛋白質(zhì)化學(xué)
一、 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)
（一）、蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子
20種氨基酸都屬于α-氨基酸，按側(cè)鏈的極性和有無(wú)電荷分為非極性側(cè)連氨基酸、不帶電荷的極性側(cè)連氨基酸、帶電荷的極性側(cè)連氨基酸。含特異遺傳密碼，也稱(chēng)編碼氨基酸。
非編碼氨基酸是在蛋白質(zhì)合成后或合成過(guò)程中由相應(yīng)的氨基酸殘基經(jīng)修飾而成的。
（二）、肽鍵與肽鏈
蛋白質(zhì)是由構(gòu)件分子氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的多聚生物大分子多肽。
肽鍵 —CO—NH— （酰胺鍵）
水解肽鍵的酶有內(nèi)肽酶和外肽酶兩類(lèi)，內(nèi)肽酶對(duì)氨基酸的種類(lèi)有選擇性；而外肽酶對(duì)氨基酸的種類(lèi)無(wú)選擇性。
10個(gè)以下的肽稱(chēng)寡肽，10個(gè)以上的肽稱(chēng)多肽。一條多肽鏈有一個(gè)C末端和一個(gè)N末端。
二硫鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中常見(jiàn)的一種共價(jià)鍵。
多肽與蛋白質(zhì)的區(qū)分通常以50-100個(gè)氨基酸為界，但并非絕對(duì)。
（三）、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容——測(cè)定方法與原理
蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定是蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和酶活性部位研究的前提。
一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本戰(zhàn)略是用兩套斷鏈方法分別將純化的蛋白質(zhì)肽鏈裂解成肽段，再將各個(gè)肽段分離純化，并測(cè)定每個(gè)肽段的順序，然后比較兩套肽段氨基酸順序以排定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。
一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定前的準(zhǔn)備
1）蛋白質(zhì)的純化 純度必須達(dá)到98%以上。
蛋白質(zhì)常用的純化方法有SDS-PAGE，高效液相層析（HPLC）。純度的鑒定常用電泳和層析法
2）、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定
常用凝膠過(guò)濾、SDS-PAGE、超速離心、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜等。
3）、蛋白質(zhì)多肽鏈數(shù)目和大小的測(cè)定
用還原性SDS-PAGE分析，若分子量變小，則說(shuō)明此蛋白質(zhì)由2條以上多肽鏈組成，然后將每條多肽鏈分離出來(lái)，分別測(cè)定其一級(jí)結(jié)構(gòu)。
4）、封閉自由巰基
游離的巰基必須封閉，否則在純化肽段時(shí)易氧化為多種產(chǎn)物。常用碘代乙酸烷化法。
5）、去除N末端封閉的基團(tuán)
N-末端有時(shí)會(huì)被封閉，應(yīng)用相應(yīng)的方法除去N-末端封閉基團(tuán)。
氨基酸組成的測(cè)定
1）、蛋白質(zhì)的水解
將蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸，水解的方法有酸水解、堿水解和酶水解。常用的是酶水解。
酸水解色氨酸全部破壞，應(yīng)添加巰基乙醇作保護(hù)劑。
2）、氨基酸的組成
經(jīng)典的氨基酸組成分析法是茚三酮法。用自動(dòng)氨基酸分析儀經(jīng)離子交換層析相繼分離，各種氨基酸與茚三酮反應(yīng)形成紫色化合物，然后在570nm及440nm波長(zhǎng)測(cè)定光吸收，計(jì)算出氨基酸的含量。
3．鏈的拆離與純化
由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)，須將不同的蛋白質(zhì)肽鏈拆開(kāi)，并分離純化。
1）、二硫鍵的拆開(kāi)
氧化法：過(guò)甲酸
還原法：巰基乙醇、巰基乙酸等
2）、共價(jià)鍵的拆開(kāi)
I）、改變pH值：蛋白質(zhì)解離的臨界pH值為3-4、9-10。
II）、強(qiáng)變性劑：尿素和鹽酸胍與巰基乙醇共用。
3）、肽鏈的分離純化
4．末端氨基酸的測(cè)定
測(cè)定末端氨基酸可確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。
1）、N-末端的測(cè)定
常用2、4-二硝基氟苯（DNFB）法、二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法、異硫氰酸苯酯（PTH）法等。
2）、C-末端的測(cè)定
常用的方法有：肼解法、羧肽酶法、還原氨基醇法等。
5．肽鏈的專(zhuān)一性裂解與肽段的分離純化
1）、肽鏈的專(zhuān)一性裂解
化學(xué)裂解法：專(zhuān)一性化學(xué)試劑：溴化氰裂解法；酸水解；堿水解
酶水解法：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶等，每一種酶都有一個(gè)專(zhuān)一的切點(diǎn)。
2）肽段的分離純化
可用層析和電泳的方法分離提純。
6．肽段氨基酸排列順序的測(cè)定
常用化學(xué)法：Edman降解法；蛋白質(zhì)序列測(cè)定儀可自動(dòng)檢測(cè)氨基酸的性質(zhì)、含量和氨基酸序列。
7．蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的建立
氨基酸排列順序測(cè)定出來(lái)以后，將小肽段重新構(gòu)成大肽段或蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
肽段重疊：將斷裂的許多肽段的氨基酸按順序排列，最后用重疊的方法確定整個(gè)多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。
原則：將一段一段小肽按一定順序排列，將各個(gè)樣品中相同的氨基酸殘基位置對(duì)準(zhǔn)重疊排列。
二硫鍵位置的確定：將完整的蛋白質(zhì)分子不經(jīng)任何處理，直接用酶或酸水解，用凝膠過(guò)濾或離子交換層析等方法及二硫鍵鑒定的顯色反應(yīng)，分離檢出其中含有二硫鍵的肽段，將肽的二硫鍵拆開(kāi)，分別測(cè)定兩個(gè)肽段的順序，將兩個(gè)肽的結(jié)構(gòu)與已測(cè)定的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，找出相應(yīng)的二硫鍵位置。
A-1 AF
A-2 AFGR
B-1 GRLY
B-2 LYKW
A-3 KW
B-3 WHS
A-4 HS
AFGRLYKWHS
二、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系
同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)差異與分子進(jìn)化
同源蛋白質(zhì)：在不同生物種屬中執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)。
不同生物體的同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸組成和順序上不同，存在種屬差異。同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可反映種屬間的親緣關(guān)系，但不影響其生物學(xué)功能。
1．胰島素
不同種屬哺乳動(dòng)物胰島素的功能相同，但其一級(jí)結(jié)構(gòu)不同。胰島素由A、B兩條鏈組成，不同種屬動(dòng)物A鏈第8、9、10三個(gè)氨基酸殘基和B鏈C-末端第30個(gè)氨基酸殘基有差別，這4個(gè)氨基酸殘基對(duì)胰島素的生物活性不起決定性作用。胰島素結(jié)構(gòu)中有20個(gè)氨基酸保持不變，是胰島素生物活性所必需的。
2．細(xì)胞色素C
帶有一個(gè)血紅素輔基的一條多肽鏈。不同動(dòng)物細(xì)胞色素C氨基酸除了不變的殘基外，還有相當(dāng)一部分是不同的，不同動(dòng)物間差異有所不同，有些差異很小，有些差異很大。
在細(xì)胞色素C不變的氨基酸殘基中，有些位置的殘基對(duì)所有生物都是不變的，這些殘基稱(chēng)保守殘基。
3．肌紅蛋白
由一個(gè)血紅素輔基和一條153個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成。不同動(dòng)物肌紅蛋白的氨基酸組成和排列順序相似，但不同。
4．血紅蛋白
由珠蛋白和亞鐵血紅素組成。不同動(dòng)物血紅蛋白α-鏈和β-鏈結(jié)構(gòu)不同，但有些有高度的相似性，如人與抹香鯨。
5．α-乳清蛋白和溶菌酶
α-乳清蛋白由123個(gè)氨基酸組成，溶菌酶由129個(gè)氨基酸組成，兩者多肽鏈的數(shù)目、氨基酸數(shù)目、鏈內(nèi)二硫鍵的位置和數(shù)目相似，為同源蛋白質(zhì)，但兩者的功能不同。
（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)差異與分子病
同種生物來(lái)源的一種蛋白質(zhì)，有時(shí)存在兩種或兩種以上形式，它們的氨基酸序列差異很細(xì)微，通常只有一二個(gè)氨基酸殘基的差別。這種細(xì)微的差別在某些情況下可引起功能的明顯變化，有時(shí)甚至引發(fā)疾病，如分子病。
分子病是由構(gòu)成生物體基本物質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變異而引起的疾病，這種變異來(lái)源于基因的突變。
基因突變的類(lèi)型：
誤義突變：由于堿基突變使某一氨基酸的密碼子變成另一氨基酸的密碼子。
無(wú)義突變：基因中某一氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼子，使多肽鏈合成提前終止。
移碼突變：基因中堿基缺失或插入，造成這一位置以后一系列或部分編碼發(fā)生移位錯(cuò)誤。
血紅蛋白基因突變可導(dǎo)致血紅蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)改變而產(chǎn)生異常血紅蛋白，引起血紅蛋白病。如鐮刀狀貧血病，β-鏈N-末端第6位谷氨酸被纈氨酸取代，使紅細(xì)胞的形狀變成鐮刀型而引起溶血。
（三）活性肽一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能
活性肽是一類(lèi)分子量小于6000，構(gòu)象松散，具有多種生物功能的小肽，其主要功能是傳遞信息，調(diào)節(jié)代謝和協(xié)調(diào)器官功能。
包括多肽激素、組織激肽、神經(jīng)肽等，其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可使活性升高、降低或消失。
根據(jù)這一特點(diǎn)，可對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造或人工合成。
三、蛋白質(zhì)分子構(gòu)象
蛋白質(zhì)分子構(gòu)象又稱(chēng)高級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的分布。
為研究方便將蛋白的結(jié)構(gòu)劃分為不同的層次，分為一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)又分為二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。
主鏈構(gòu)象
1．α-螺旋
（1）多肽鏈以α-碳原子為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，以肽鏈平面為單位，通過(guò)兩側(cè)結(jié)合鍵的旋轉(zhuǎn)，形成穩(wěn)定的右手螺旋；
（2）每圈螺旋有3.6個(gè)氨基酸殘基，螺距為0.54nm，每個(gè)氨基酸殘基圍繞螺旋中心軸旋轉(zhuǎn)100o，上升0.15nm；
（3）相鄰兩個(gè)螺旋之間形成鏈內(nèi)氫鍵，其方向與螺旋軸平行，氫鍵由第1個(gè)氨基酸殘基N原子上的H與其后第4個(gè)氨基酸殘基羰基的O原子之間形成。
（4）各氨基酸殘基測(cè)鏈R基團(tuán)均伸向螺旋外側(cè)；
（5）α-螺旋有左手和右手兩種，天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手螺旋。
2．β-折疊
存在于大量絲蛋白和β-角蛋白中。
有兩條或多條伸展的肽鏈借助鏈間氫鍵形成的折疊片層結(jié)構(gòu)，氫鍵與鏈垂直，-碳原子處于折疊角上，側(cè)鏈交替出現(xiàn)在片層結(jié)構(gòu)的上下方，并與片層垂直。
有順式平行、反式平行或順?lè)雌叫薪惶妗?br>
3．β-轉(zhuǎn)角
多肽鏈180o回折形成的特殊結(jié)構(gòu)，由4個(gè)氨基酸殘基組成，第1和第4之間形成氫鍵。
4．發(fā)夾結(jié)構(gòu)
伸展的多肽鏈彎曲、彼此靠近并呈反向平行的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。
5．Ω環(huán)
由6-16個(gè)氨基酸殘基卷曲形成的Ω型結(jié)構(gòu)。
6．無(wú)規(guī)則卷曲
主鏈形成沒(méi)有規(guī)則的卷曲。
7．三股螺旋
由三條左手螺旋的多肽鏈相互纏繞形成右手三股螺旋。
側(cè)鏈構(gòu)象
1. 疏水區(qū)
多肽鏈中具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，其側(cè)鏈有疏水趨勢(shì)，當(dāng)許多這類(lèi)非極性側(cè)鏈聚集在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部時(shí)變形成疏水區(qū)。
許多球蛋白分子中都存在這種疏水區(qū)，與蛋白質(zhì)的功能有關(guān)，如與配基的結(jié)合。
2．親水區(qū)
氨基酸的極性側(cè)鏈趨向于分布在球蛋白分子的表面，形成一個(gè)親水區(qū)，有助于穩(wěn)定球蛋白的構(gòu)象并增加蛋白質(zhì)的水溶性。與蛋白質(zhì)的功能有關(guān)，如酶的活性中心。
二級(jí)結(jié)構(gòu)
指多肽鏈主鏈骨架全部或部分按一定規(guī)律排列形成的空間結(jié)構(gòu)，不涉及側(cè)鏈構(gòu)象，如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等。
二級(jí)結(jié)構(gòu)的類(lèi)型主要是α-螺旋，其次是β-折疊，在不同的蛋白質(zhì)中這兩種結(jié)構(gòu)所占的比例不同，多數(shù)蛋白質(zhì)具有α-螺旋、β-折疊的混合結(jié)構(gòu)。
超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域
1．超二級(jí)結(jié)構(gòu)
蛋白中存在由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元按一定規(guī)律組合在一起，形成在空間上可彼此區(qū)別的結(jié)構(gòu)單位，稱(chēng)超二級(jí)結(jié)構(gòu)。主要涉及α-螺旋和β-折疊在空間的組合、排布。
（1）αα：由兩股或三股右手α-螺旋纏繞形成的一種緊密的左手超螺旋。
（2）β×β：由兩段平行的β-折疊鏈借助一段連接鏈組成，連接鏈可以是無(wú)規(guī)則卷曲或α-螺旋。最常見(jiàn)的組合包含3段平行β-折疊和2段α-螺旋。
（3）βββ：由反向平行的β-折疊組成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要包括β-迂回和回型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。β-迂回中的β-折疊鏈通過(guò)緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接，回型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的β-折疊是通過(guò)一般的肽鏈越過(guò)反平行β-折疊形成的圓筒結(jié)構(gòu)相連。
2．結(jié)構(gòu)域
在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，一條多肽鏈上常存在一些緊密的、相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，稱(chēng)結(jié)構(gòu)域。
結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能單位和折疊單位，是在二級(jí)結(jié)構(gòu)和超二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定區(qū)域，參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的裝配，并與蛋白質(zhì)的許多功能有密切關(guān)系。
蛋白種結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不等，一種蛋白質(zhì)分子中的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，有的十分相似，有的完全不同。
蛋白質(zhì)中結(jié)構(gòu)域之間的連接不盡相同，彼此獨(dú)立的球狀結(jié)構(gòu)域之間可借柔性肽鏈松散連接，有些結(jié)構(gòu)域之間接觸緊密而又廣泛，每個(gè)結(jié)構(gòu)域所具有的表面就是肽鏈構(gòu)象外表面的一部分。
結(jié)構(gòu)域的類(lèi)型：
（1）α-螺旋域：主要是α-螺旋，由4個(gè)接近等長(zhǎng)的α-螺旋依次與其鄰近的螺旋相連形成的近四方體結(jié)構(gòu)。
（2）β-折疊域：由反平行的β-折疊構(gòu)成。常見(jiàn)的是由回型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形成的圓筒構(gòu)象。
（3）α+β域：由α-螺旋和β-折疊不規(guī)則堆積形成的。
（4）α/β域：α-螺旋和β-折疊和交替出現(xiàn)。
（5）無(wú)αβ域：結(jié)構(gòu)域中不含α-螺旋和β-折疊。
結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)構(gòu)象和功能的意義：
（1）多肽鏈先分別折疊成幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，再進(jìn)一步形成完整的構(gòu)象，比直接折疊成天然構(gòu)象在動(dòng)力學(xué)上更合理。
（2）結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)共價(jià)鍵連接，可僅借助一條或少數(shù)幾條柔性的肽鏈而連接，在結(jié)構(gòu)上具有可運(yùn)動(dòng)性。
（3）結(jié)構(gòu)域之間連接的相對(duì)靈活性有利于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的運(yùn)動(dòng)性，可直接或間接地參與蛋白質(zhì)的多種功能，如分子識(shí)別和相互作用等。
（4）結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單位，不同結(jié)構(gòu)域有不同的功能，可完成底物結(jié)合、催化反應(yīng)、亞基間的相互作用及調(diào)節(jié)活性等多種功能。
（5）結(jié)構(gòu)域可作為重要折疊單位，在新生肽鏈形成特定空間結(jié)構(gòu)的過(guò)程中起重要作用。
（五）蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)
具有特定氨基酸序列的多肽鏈，在形成空間構(gòu)象時(shí)，先由相鄰的氨基酸殘基形成一些有規(guī)則的結(jié)構(gòu)單元，并由相鄰的的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而折疊成一些相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，最后構(gòu)建成完整的、具有生物活性的構(gòu)象，這種構(gòu)象稱(chēng)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
1．球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的特征
（1）多肽鏈借助各種結(jié)構(gòu)單元、超二級(jí)結(jié)構(gòu)等折疊成緊密的球狀構(gòu)象，構(gòu)象中的螺旋以右手α-螺旋為主，肽鏈轉(zhuǎn)折處為β-轉(zhuǎn)角，有較多的無(wú)規(guī)則卷曲連接各種結(jié)構(gòu)單元。
（2）非極性側(cè)鏈位于分子內(nèi)部的疏水區(qū)，極性側(cè)鏈位于分子表面形成親水區(qū)。
（3）分子表面由內(nèi)陷的疏水空穴，是蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別和結(jié)合的關(guān)鍵部位，參與蛋白質(zhì)的多種功能。
（4）同類(lèi)球蛋白具有基本相同的三級(jí)結(jié)構(gòu)，不同種類(lèi)球蛋白具有完全不同的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
（5）球蛋白分子結(jié)構(gòu)既具有專(zhuān)一性，又具有靈活性， 二者的高度協(xié)調(diào)統(tǒng)一是球蛋白功能的多樣性和復(fù)雜性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
2．肽的構(gòu)象
分子量較大的多肽構(gòu)象與蛋白質(zhì)接近，由于主鏈和側(cè)鏈相互作用和制約較少，其構(gòu)象不如蛋白質(zhì)穩(wěn)定，具有很大的靈活性，有助于其參與體內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié)。
（六）蛋白質(zhì)分子的四級(jí)結(jié)構(gòu)
亞基：分子量較大的球蛋白分子由兩條或多條多肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵連接形成，其中每條肽鏈都有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為亞基。
四級(jí)結(jié)構(gòu)：各亞基間相互作用并組裝成有生物活性的特定構(gòu)象稱(chēng)四級(jí)結(jié)構(gòu)。
單體：蛋白質(zhì)聚合物中的一個(gè)蛋白分子。
亞基必須通過(guò)非共價(jià)鍵組裝成完整的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才具有生物活性，寡聚蛋白可由相同或不同的亞基組裝，如不同亞基組裝的蛋白質(zhì)分子可出現(xiàn)多種亞基結(jié)合形式，如乳酸脫氫酶。
四、蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系
一）、分子識(shí)別
是指蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、核酸、脂等分子之間特異的辨認(rèn)。對(duì)機(jī)體完成許多過(guò)程至關(guān)重要，如抗原—抗體、酶—底物的特異結(jié)合、基因表達(dá)調(diào)控等。
蛋白質(zhì)分子識(shí)別的機(jī)制
以往的概念認(rèn)為，抗原—抗體、酶—底物、激素—受體等蛋白復(fù)合物的形成中是相互作用的兩個(gè)分子之間整個(gè)互補(bǔ)界面的相互作用，涉及整體空間構(gòu)象的識(shí)別與契合。
近年來(lái)的研究認(rèn)為，結(jié)合的兩個(gè)分子之間的相互作用來(lái)自少數(shù)幾個(gè)關(guān)鍵基團(tuán)之間的次級(jí)鍵，用含有這幾個(gè)關(guān)鍵基團(tuán)的線(xiàn)形肽可模擬相應(yīng)完整蛋白質(zhì)的作用。這表明蛋白質(zhì)生物大分子之間的相互作用可能主要局限在幾個(gè)關(guān)鍵基團(tuán)的相互作用。通過(guò)研究小肽片段的特異性相互作用，可能會(huì)揭示蛋白質(zhì)分子識(shí)別乃至復(fù)雜的超分子體系的自我組裝等問(wèn)題，并為小肽分子藥物和疫苗的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
小肽片段與生物大分子之間的識(shí)別，并不意味著含有這種小肽片段的蛋白質(zhì)就可以與相應(yīng)的大分子結(jié)合，只有具有一定構(gòu)象的小肽序列才可與大分子結(jié)合。提示在蛋白質(zhì)分子識(shí)別和相互作用過(guò)程中，識(shí)別區(qū)域的構(gòu)象也起著關(guān)鍵作用。
2．蛋白質(zhì)與核酸的識(shí)別
1）、調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)域
蛋白質(zhì)與核酸的識(shí)別和相互作用是基因表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白與DNA識(shí)別和結(jié)合的模式有多種類(lèi)型，主要決定于調(diào)控蛋白的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的不同。
I、螺旋—轉(zhuǎn)折—螺旋
兩段螺旋被一段β-轉(zhuǎn)角分開(kāi)，其中一段辨認(rèn)螺旋，直接與暴露在DNA大溝中的堿基對(duì)接觸結(jié)合。辨認(rèn)和結(jié)合的作用力包括氫鍵、離子鍵、范德華力。這種結(jié)構(gòu)主要以二聚體形式與DNA結(jié)合。
在真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中幼兒還存在同源（異型）結(jié)構(gòu)域，主要以單體形式通過(guò)螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋與DNA進(jìn)行多位點(diǎn)結(jié)合，以保證識(shí)別的特異性。
II、鋅指結(jié)構(gòu)
一個(gè)Zn++與4個(gè)Cys或2個(gè)Cys、2個(gè)His靠配位鍵結(jié)合，有一個(gè)疏水核心和極性表面，并有象手指一樣伸出的肽段，其數(shù)目為一個(gè)或多個(gè)。
鋅簇結(jié)構(gòu)：存在于真菌轉(zhuǎn)錄因子中，在其DNA結(jié)合區(qū)有60個(gè)左右的氨基酸殘基，由6個(gè)Cys與2個(gè)Zn++形成鋅簇的核心。
鋅扭結(jié)構(gòu)：存在于高等動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)類(lèi)固醇激素受體家族、受體蛋白與DNA相結(jié)合的區(qū)域，該區(qū)域約含150個(gè)氨基酸殘基，直接與DNA結(jié)合的有40-60個(gè)氨基酸殘基，其中有8個(gè)Cys與2個(gè)Zn++通過(guò)配位鍵形成2個(gè)四面體結(jié)構(gòu)，有15個(gè)殘基將2個(gè)Zn++隔開(kāi)，形成扭形的DNA結(jié)合位點(diǎn)。
III、亮氨酸拉鏈
是α-螺旋中一段富含有規(guī)律出現(xiàn)的亮氨酸殘基的片段，能形成2個(gè)α-螺旋，即螺旋的一側(cè)是以帶電荷的氨基酸殘基為主，具有親水性；另一側(cè)是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，稱(chēng)亮氨酸拉鏈。
具有亮氨酸拉鏈的蛋白質(zhì)都以二聚體的形式與DNA結(jié)合。
IV、螺旋—環(huán)—螺旋
2個(gè)α-螺旋的中間被一段非螺旋的環(huán)分隔。與DNA結(jié)合性質(zhì)與亮氨酸拉鏈相似，易形成二聚體。α-螺旋氨基端有堿性區(qū)，是結(jié)合DNA所必須是，螺旋區(qū)是形成二聚體所必須的。
2）、蛋白質(zhì)與DNA識(shí)別機(jī)制
與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子主要包括轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
蛋白因子與DNA識(shí)別的機(jī)制目前尚不完全清楚，但已獲得某些特點(diǎn)與規(guī)律：（1）、蛋白因子以二聚體的形式結(jié)合特異的DNA序列，異源二聚體的親和力大于同源二聚體。
（2）、蛋白因子的識(shí)別結(jié)構(gòu)域與DNA的大溝或小溝識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。其中一個(gè)螺旋為專(zhuān)一性結(jié)合，另一個(gè)螺旋為非特異性結(jié)合。
（3）、識(shí)別螺旋有幾圈，其氨基酸殘基分為與DNA接觸的殘基、與DNA主鏈磷酸基團(tuán)接觸的殘基和與蛋白其他部分接觸的殘基。這些特定殘基決定螺旋在DNA大溝內(nèi)的傾斜狀態(tài)，對(duì)識(shí)別有重要作用。
（4）、DNA上的結(jié)合有幾個(gè)堿基對(duì)。蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)DNA構(gòu)象發(fā)生變化有助于結(jié)合。
（5）、蛋白質(zhì)—DNA間的相互作用主要為極性作用，同時(shí)也有疏水作用，識(shí)別的特異性主要來(lái)自氨基酸與堿基間的化學(xué)接觸。
（二）蛋白質(zhì)的折疊
1．新生肽鏈折疊的特點(diǎn)
根據(jù)煙草花葉病毒外殼蛋白與核糖核酸在體外生理?xiàng)l件下能自組裝成感染活性的病毒這一現(xiàn)象，人們?cè)J(rèn)為新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)可在一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，自動(dòng)地折疊成天然構(gòu)象，不需要其他分子或能量的支持，但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)了兩種幫助蛋白折疊的輔助蛋白和酶，因而現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為：細(xì)胞內(nèi)新生肽鏈的折疊是需要幫助的。
I、折疊啟動(dòng)：有三種假說(shuō)
疏水塌縮啟動(dòng)折疊：肽鏈中的疏水作用力可導(dǎo)致肽段中形成疏水簇，再進(jìn)入折疊中間狀態(tài)。
二級(jí)結(jié)構(gòu)生成啟動(dòng)折疊：小肽在水溶液中可形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)中可作為折疊的起始點(diǎn)。
特殊作用力啟動(dòng)折疊：對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有重要作用的化學(xué)鍵的形成可啟動(dòng)蛋白質(zhì)折疊。
II、中間狀態(tài)
目前已發(fā)現(xiàn)多種折疊中間狀態(tài)，如與二硫鍵有關(guān)的中間態(tài)、脯氨基順?lè)串悩?gòu)中間態(tài)及熔球態(tài)等。其中熔球態(tài)是蛋白質(zhì)折疊中最主要的一類(lèi)折疊中間態(tài)。
III、折疊途徑
有人認(rèn)為是能量?jī)?yōu)化的單一折疊途徑；有人認(rèn)為是涉及復(fù)雜動(dòng)力學(xué)過(guò)程的多折疊途徑。
2．分子伴侶
是一類(lèi)相互之間沒(méi)有關(guān)系的蛋白質(zhì)，其功能是幫助含多肽鏈的其他結(jié)構(gòu)組分在體內(nèi)以非共價(jià)鍵組裝，且不存在于組裝后發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)中。
目前已確認(rèn)的分子伴侶分為三個(gè)蛋白家族：伴侶素60家族、應(yīng)激蛋白70家族和應(yīng)激蛋白90家族。
分子伴侶與新生肽鏈識(shí)別、結(jié)合及解離以完成新生肽鏈折疊的機(jī)制目前尚不清楚。
3．幫助新生肽鏈折疊的酶
目前已確定的有兩種：蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、肽酰脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶（PPI）。
4．蛋白質(zhì)折疊在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用
蛋白質(zhì)合成之后需要運(yùn)送到細(xì)胞的各部分，這一過(guò)程需要經(jīng)歷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在轉(zhuǎn)運(yùn)之前蛋白質(zhì)必須處于解折疊狀態(tài)，轉(zhuǎn)運(yùn)之后在進(jìn)行折疊。這種解折疊與再折疊過(guò)程中可有分子伴侶參與。
5．蛋白質(zhì)的折疊模式
許多問(wèn)題尚不清楚，如一級(jí)結(jié)構(gòu)同源，空間構(gòu)象存在相似性；一級(jí)結(jié)構(gòu)不同源，空間構(gòu)象存在相似性（功能相似或功能不相似）。
6．蛋白質(zhì)折疊家族
根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸順序和功能的相似性，把某些蛋白質(zhì)劃分為家族。一個(gè)蛋白家族一般屬于同源蛋白質(zhì)，在進(jìn)化上有一定聯(lián)系，在空間結(jié)構(gòu)上有相似的折疊方式。
（三）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定和預(yù)測(cè)
蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定是研究蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，也是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。
蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定方法：晶體蛋白——X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)
溶液蛋白——核磁共振結(jié)構(gòu)分析技術(shù)
此外還有質(zhì)普法、中子衍射技術(shù)等。
蛋白質(zhì)構(gòu)象的預(yù)測(cè)是根據(jù)分子構(gòu)象理論及已知空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出的一些構(gòu)象規(guī)律，用概率統(tǒng)計(jì)方法來(lái)預(yù)測(cè)大量已知一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的構(gòu)象，可為設(shè)計(jì)具有特定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)，目前主要集中在對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
利用定點(diǎn)突變等分子生物學(xué)技術(shù)，改變組成蛋白質(zhì)分子的某個(gè)氨基酸殘基，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，是蛋白質(zhì)工程的主要研究?jī)?nèi)容。這一工作是建立在對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象預(yù)測(cè)基礎(chǔ)上的。如果能預(yù)測(cè)出產(chǎn)生某種特定新功能的蛋白質(zhì)構(gòu)象應(yīng)具有的氨基酸序列，可減少蛋白質(zhì)工程的盲目性。
蛋白質(zhì)工程最引人注目的是從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的蛋白質(zhì)分子，創(chuàng)造自然界中不存在的優(yōu)良蛋白質(zhì)。
（四）蛋白質(zhì)的變性
1．變性的定義
蛋白質(zhì)變性是指蛋白質(zhì)分子受到某些理化因素作用后，天然構(gòu)象發(fā)生改變，生物活性喪失、某些理化性質(zhì)發(fā)生改變的過(guò)程。
物理性質(zhì)：溶解度下降、沉淀、粘度增加、紫外和熒光光譜發(fā)生改變。
化學(xué)性質(zhì)：易被蛋白酶水解，可與多種試劑發(fā)生反應(yīng)。
2．變形因素與作用機(jī)制
理化因素，不同因素引起的變性機(jī)制不同。
熱變性：溫度升高使分子內(nèi)振動(dòng)增強(qiáng)，破壞了維持空間構(gòu)象穩(wěn)定的次級(jí)鍵及某些二硫鍵。
超聲波：直接破壞某些次級(jí)鍵。
酸、堿：使蛋白質(zhì)所帶的電荷發(fā)生改變，離子鍵斷裂，從而導(dǎo)致構(gòu)象松散。
尿素、鹽酸胍：是常用的蛋白質(zhì)變性劑，可能是破壞了蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和分子內(nèi)的疏水力。
表面活性劑（如SDS、Triton X-100）：表面所帶的負(fù)電荷改變了蛋白質(zhì)的電荷分布，使分子構(gòu)象發(fā)生改變。
有機(jī)溶劑：改變蛋白質(zhì)分子中的靜電引力、氫鍵和疏水作用力，使構(gòu)象發(fā)生改變。
3．變性過(guò)程
包括寡聚蛋白分子解離成亞基，肽鏈從緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮顟B(tài)，再?gòu)挠行虻亩?jí)結(jié)構(gòu)變成無(wú)規(guī)則的線(xiàn)團(tuán)。
但酶在變性時(shí)活性喪失在先，分子整體構(gòu)象變化在后，這表明活性部位先發(fā)生構(gòu)象變化。
4．可逆變性與不可逆變性
變性的蛋白質(zhì)由于一級(jí)結(jié)構(gòu)并未受到破壞，在除去變性因素后，有些蛋白質(zhì)在適當(dāng)條件下可由變性狀態(tài)恢復(fù)為天然構(gòu)象并表現(xiàn)出生物活性，這種變性稱(chēng)為可逆變性。不能恢復(fù)的稱(chēng)為不可逆變性。
SDS、巰基乙醇、尿素引起的變性屬于可逆變性，大多數(shù)變性是不可逆的。
表明變性蛋白質(zhì)的體外重折疊與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊有相當(dāng)大的差別，變性的蛋白質(zhì)無(wú)法重新折疊成天然構(gòu)象。
5．復(fù)性
沒(méi)有活性的變性蛋白質(zhì)在適當(dāng)條件下重新折疊成有活性的天然構(gòu)象的過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。復(fù)性的實(shí)質(zhì)是多肽鏈在體外的重新折疊。
重新折疊的機(jī)制目前仍不清楚，有些蛋白質(zhì)可在幾秒鐘內(nèi)在體外重新折疊而恢復(fù)天然構(gòu)象、生物活性；有些蛋白質(zhì)的復(fù)性需要較長(zhǎng)的時(shí)間，而大多數(shù)蛋白質(zhì)無(wú)法復(fù)性。
蛋白質(zhì)的無(wú)法復(fù)性可能是由于在體外的重新折疊導(dǎo)致了錯(cuò)誤的折疊。
（五）蛋白質(zhì)的變構(gòu)
蛋白質(zhì)在發(fā)揮功能時(shí)由于分子內(nèi)的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變。
變構(gòu)蛋白都屬于寡聚蛋白，除血紅蛋白和變構(gòu)酶外還包括細(xì)胞膜上的某些蛋白質(zhì)及基因調(diào)控蛋白等，具有許多重要功能。
血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)：血紅蛋白與肌紅蛋白結(jié)合氧的特性不同，以氧分壓為橫坐標(biāo)，氧飽和度為縱坐標(biāo)，可得到兩種蛋白的氧結(jié)合曲線(xiàn)。血紅蛋白為S型曲線(xiàn)，肌紅蛋白為雙曲線(xiàn)。
血紅蛋白的S型氧合曲線(xiàn)反映了它與氧結(jié)合的特點(diǎn)。血紅蛋白分子由于4個(gè)亞基間的相互作用，四聚體與氧剛開(kāi)始結(jié)合時(shí)親和力遠(yuǎn)低于肌紅蛋白，分子中的α亞基對(duì)氧的親和力比β亞基大，能首先與第一個(gè)氧分子結(jié)合，導(dǎo)致α亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，并進(jìn)而使相臨的β亞基構(gòu)象也發(fā)生變化，從而增加β亞基對(duì)氧的親和力。當(dāng)血紅蛋白結(jié)合上第一個(gè)氧分子后，它與氧的結(jié)合能力由于變構(gòu)作用而逐漸增加，呈現(xiàn)S型曲線(xiàn)。
肌紅蛋白由于只有一條多肽鏈，與氧的親和力較大，在很低的氧分壓下即接近飽和。
波爾效應(yīng)：增加CO2的壓力或H+的濃度都能降低血紅蛋白對(duì)氧的親和力，使血紅蛋白的氧結(jié)合曲線(xiàn)右移，促進(jìn)氧的釋放；而高濃度的氧可促使血紅蛋白分子釋放H+和CO2，這種現(xiàn)象稱(chēng)為波爾效應(yīng)。
五、蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定
（一）蛋白質(zhì)分離純化的一般程序
分離純化的一般步驟：
1．選擇一種目的蛋白含量豐富，穩(wěn)定性好的樣品材料。
2．將蛋白質(zhì)從樣品中抽提出來(lái)。
3．確定分離純化的方法，使粗品的純度達(dá)到預(yù)定要求。
4．建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)手段，分步測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，檢驗(yàn)蛋白質(zhì)的純度。
5．在操作分析過(guò)程中注意保護(hù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，防止變性。
（二）前處理
1、生物樣品的選擇與處理
生物樣品選擇的原則是：有效成分含量豐富、穩(wěn)定性好、來(lái)源豐富、保持新鮮、實(shí)驗(yàn)條件恒定、取材工藝簡(jiǎn)單、有綜合利用價(jià)值等。
選擇好樣品后應(yīng)及時(shí)使用或在-20℃以下冰箱保存。
2．細(xì)胞破碎
I、機(jī)械破碎法
II、物理學(xué)方法：超聲波、擠壓、反復(fù)凍溶等
III、化學(xué)法：有機(jī)溶劑或表面活性劑
IV、酶學(xué)法：用適當(dāng)?shù)拿钙茐募?xì)胞壁
3．抽提
用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，使有效成分充分溶解到溶劑中的過(guò)程。抽提液具備的條件：對(duì)有效成分溶解度大、破壞性小、對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很小、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全。
抽提過(guò)程中應(yīng)注意的因素：
1）、溶劑的pH值：應(yīng)偏離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，但不宜過(guò)高或過(guò)低。
2）、溶劑的離子強(qiáng)度：用離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液，鹽濃度在0.02-0.5mol/ml范圍內(nèi)。與脂質(zhì)結(jié)合牢固的蛋白質(zhì)用有機(jī)溶劑抽提。
3）、溫度：抽提溫度不宜高，應(yīng)控制在0-10℃。
4）、抽提液的體積：抽提液一般為抽提物的3-5倍。
5）、添加保護(hù)劑：加巰基乙醇或EDTA保護(hù)巰基形成二硫鍵或與金屬離子結(jié)合。
（三）蛋白質(zhì)的分離純化方法
1．利用溶解度不同的分離純化方法
I、鹽析法
在稀鹽溶液中蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶。而當(dāng)鹽濃度增加到一定量時(shí)其溶解度逐漸下降，直到某一濃度時(shí)從溶液中析出，稱(chēng)為鹽析。
用于鹽析的中性鹽常用硫酸銨，不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，調(diào)節(jié)鹽的濃度可適當(dāng)?shù)貙⒌鞍踪|(zhì)分離。對(duì)含有多種蛋白質(zhì)的混合液可采用分段鹽析的方法分離純化。
II、等電點(diǎn)沉淀法
III、有機(jī)溶劑沉淀法：（1）降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子中帶相反電荷的基團(tuán)吸引力增大、凝集。（2）與蛋白質(zhì)爭(zhēng)奪水膜，使蛋白質(zhì)凝集并沉淀析出。（3）破壞氫鍵，引起構(gòu)象改變。
IV、聚乙二醇沉淀法：其分子量在400-6000之間。
2．利用分子大小和形狀不同的分離純化方法
I、透析和超濾
II、密度梯度離心
蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，可根據(jù)其分子量和密度的不同進(jìn)行分離，每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被 分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。
常用的梯度介質(zhì)為蔗糖。
III、凝膠過(guò)濾
3．利用電離性質(zhì)不同的分離純化方法
I、離子交換層析
II、聚焦層析
III、制備電泳：電泳后使分離區(qū)帶從聚丙烯酰胺凝膠管下端流出，用洗脫液洗脫到部分收集器中。
4．利用吸附能力不同的分離純化方法：吸附層析
5．利用生物功能專(zhuān)一性的純化方法：親合層析
（四）蛋白質(zhì)的純度鑒定
1．電泳法
醋酸纖維素薄膜
瓊脂糖凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳
SDS-PAGE
梯度PAGE
等電聚焦電泳
雙相PAGE
印跡轉(zhuǎn)移電泳：通過(guò)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)再次經(jīng)過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到固相載體表面，然后進(jìn)行染色分析電泳帶。常用的載體為硝酸纖維薄膜，醋酸纖維薄膜等。常用于檢測(cè)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等之間的相互作用。
毛細(xì)管電泳：快速、分辨率高、樣品用量少。
2．免疫法
免疫擴(kuò)散、免疫電泳、酶聯(lián)免疫吸附、免疫印跡
3．分光光度法
4．超速離心
5．高效液相層析
第二講 酶學(xué)
一、酶的催化機(jī)理
（一）酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性中心
1、酶分子的結(jié)構(gòu)特征
酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的相同。除少數(shù)單體酶外，大多數(shù)酶是由多個(gè)亞基組成的寡聚體。多數(shù)情況下每個(gè)亞基有一個(gè)活性部位，有些酶的活性部位是由一個(gè)以上亞基組成的，對(duì)于多功能酶來(lái)講不同的亞基有不同的功能。
酶分子中除活性中心外，還有其他的功能部位，如抑制劑、激活劑、別構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合部位，亞基相互識(shí)別、相互結(jié)合部位等。
2、酶的活性中心與必需基團(tuán)
酶分子上和酶活性有直接關(guān)系的特異氨基酸殘基，集中在酶分子的一個(gè)特定區(qū)域，即為酶的活性中心或活性部位。
酶分子活性中心的化學(xué)基團(tuán)，實(shí)際上是某些氨基酸殘基的側(cè)鏈或肽鏈末端氨基或羧基，它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)距離較遠(yuǎn)，但空間結(jié)構(gòu)相對(duì)集中。
活性中心內(nèi)的化學(xué)基團(tuán)是酶發(fā)揮催化作用及與底物直接接觸的基團(tuán)，稱(chēng)為活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)?；钚灾行耐獾囊恍┗鶊F(tuán)，雖不直接參與催化作用，但對(duì)維持整個(gè)酶分子空間構(gòu)象及酶的活性是必需的，稱(chēng)為活性中心外的必需基團(tuán)。
活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)又分為催化基團(tuán)和底物結(jié)合基團(tuán)。
催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)是相互聯(lián)系的整體，催化效率的高低很大程度上取決于底物結(jié)合的位置是否合適，只有結(jié)合基團(tuán)正確地結(jié)合底物，提供催化基團(tuán)發(fā)揮作用的最優(yōu)構(gòu)象，才能有效發(fā)揮催化作用。
3、酶活性中心的結(jié)構(gòu)
同一酶或功能相近的酶，其活性中心附近的氨基酸序列具有驚人的相似性，而序列的差異常發(fā)生在遠(yuǎn)離活性中心的地方。不同的酶，其活性中心雖有某些共同的氨基酸殘基，但它們鄰近的氨基酸殘基序列卻很少相同。
酶活性中心出現(xiàn)頻率最高的氨基酸是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的氨基酸殘基在結(jié)構(gòu)上都具有一些特殊的側(cè)鏈基團(tuán)，如巰基酶類(lèi)的-SH、絲氨基酶類(lèi)的-OH、組氨基酶類(lèi)的咪唑基。
酶活性中心有一個(gè)疏水的三維環(huán)境，具有一定的柔性，在底物誘導(dǎo)下可發(fā)生構(gòu)象的改變，以適宜結(jié)合底物的狀態(tài)。
輔助因子對(duì)酶活性中心的構(gòu)象和酶的催化性質(zhì)都有重要影響作用。
酶活性中心研究的方法有：化學(xué)修飾法、親和標(biāo)記、動(dòng)力學(xué)分析法、X-射線(xiàn)衍射分析法、基因定位誘變法。
（二）酶降低反應(yīng)活化能的機(jī)理
1．活化能與過(guò)度態(tài)
對(duì)任何活化反應(yīng)，反應(yīng)物分子或底物分子在轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物之前都必需獲得一定的能量成為活化態(tài)或過(guò)度態(tài)。反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的關(guān)鍵步驟是原來(lái)的化學(xué)鍵斷裂和新化學(xué)鍵的形成，而過(guò)度態(tài)正是這種轉(zhuǎn)變的中途點(diǎn)。初始反應(yīng)處于基態(tài)能階，產(chǎn)物處于另一基態(tài)能階，過(guò)度態(tài)與反應(yīng)物的能階之差稱(chēng)為活化能。
初始反應(yīng)物要發(fā)生反應(yīng)，必須具有高于或等于活化能的能階水平才有可能進(jìn)入過(guò)度態(tài)，因此要使一個(gè)化學(xué)反應(yīng)速度加快，一是增加反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的機(jī)率，二是降低反應(yīng)的活化能水平。
催化劑降低反應(yīng)活化能的效應(yīng)是通過(guò)改變反應(yīng)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，使反應(yīng)沿著低活化能的途徑進(jìn)行，即使反應(yīng)途徑分成若干步進(jìn)行，而各步的活化能都不太大，總的活化能水平較低。
2．酶—底物復(fù)合物的生成與酶催化
酶作為生物催化劑之所以能發(fā)揮高效的催化性，在于酶和底物反應(yīng)過(guò)程中形成了特殊的酶—底物復(fù)合物，此過(guò)度態(tài)的復(fù)合物很不穩(wěn)定，可即刻轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的產(chǎn)物，使反應(yīng)的總活化能降低。
3．降低活化能的因素
過(guò)度態(tài)中間復(fù)合物的形成，導(dǎo)致活化能的降低是酶催化反應(yīng)的關(guān)鍵。
（1）、酶的鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)
鄰近效應(yīng)：是指酶由于具有與底物有較高的親和力，從而使游離的底物集中于酶分子表面的活化中心區(qū)域，使活性中心的底物有效濃度得以極大的提高，并同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)之間相互靠近，增加親核攻擊的機(jī)會(huì)，從而提高反應(yīng)速度。
定向效應(yīng)：指底物的反應(yīng)基團(tuán)和催化基團(tuán)之間或底物的反應(yīng)基團(tuán)之間正確地取向
產(chǎn)生的效應(yīng)。
反應(yīng)基團(tuán)的正確取向和定位增加底物的激活，從而加快反應(yīng)。
對(duì)酶催化來(lái)說(shuō)，鄰近和定向效應(yīng)是共同產(chǎn)生催化效應(yīng)的。
（2）、底物分子形變或扭曲
酶受底物誘變發(fā)生構(gòu)象改變，活性中心的基團(tuán)發(fā)生位移或改向，但同時(shí)酶活性中心的基團(tuán)可引起底物形變，削弱有關(guān)的化學(xué)鍵，使底物由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)度態(tài)，有利于反應(yīng)進(jìn)行。
（3）、酸堿催化
酶由于活性中心存在酸性或堿性氨基酸，可作為酸堿催化劑，即可作為催化性質(zhì)的質(zhì)子受體或供體，有效地進(jìn)行酸堿催化。
（4）、共價(jià)催化
酶活性中心存在親核基團(tuán)和親電子基團(tuán)，可對(duì)底物進(jìn)行親核和親電子反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的共價(jià)中間復(fù)合物，降低反應(yīng)活化能，加速反應(yīng)進(jìn)行。
（5）、活性中心的低介電性
酶活性中心是一個(gè)疏水的非極性環(huán)境，其催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍，催化反應(yīng)在低介電常數(shù)介質(zhì)中的反應(yīng)速度比高介電常數(shù)介質(zhì)中的快得多。
二、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
（一）底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
在酶促反應(yīng)中，盡管酶必須參加反應(yīng)，但酶不被消耗，而只起循環(huán)作用，反應(yīng)速度只依賴(lài)于反應(yīng)物。在其他條件不變，[E]恒定條件下，酶促反應(yīng)速度與底物濃度之間呈雙曲線(xiàn)關(guān)系。
當(dāng)[S]很低時(shí)，V隨[S]增加而迅速增加，V與[S]成正比；當(dāng)[S]很高時(shí)，V隨[S]升高而加速，但V的增加不如[S]低時(shí)那樣顯著；當(dāng)[S]增加到一定值后，再增加底物，V不再增加，達(dá)到一恒定值。
這種雙曲線(xiàn)關(guān)系是由于底物在轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物之前，必須先與酶形成中間復(fù)合物，再轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物并釋放酶。
1931年Michaeleis和Menten在中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)上建立了V與[S]關(guān)系的雙曲線(xiàn)方程，即米氏方程：v=Vm/（Km+[S]）
酶反應(yīng)速度是衡量酶活性大小的指標(biāo)，用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加或底物的減少來(lái)表示。
用[p]對(duì)t作圖得酶促反應(yīng)速度曲線(xiàn)。曲線(xiàn)的斜率即為反應(yīng)速度，表示單位時(shí)間內(nèi)[p]的變化。曲線(xiàn)上某一點(diǎn)的斜率即為該時(shí)刻的反應(yīng)速度。
根據(jù)米氏方程，Km等于反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，即Km=[S]。
Km在酶學(xué)、藥物代謝研究和臨床工作中都有重要作用和應(yīng)用價(jià)值。
（1）、鑒別酶的最適底物
Km的大小可近似地表示酶和底物的親和力，即Km=[E][S]/[ES]。
Km值大表示酶與底物的親和力小，反之則大。具有最小Km值的底物即為該酶的最適底物或天然底物。
（2）、判斷在細(xì)胞內(nèi)酶的活性是否受底物抑制
如果測(cè)得離體酶的Km遠(yuǎn)低于細(xì)胞內(nèi)的底物濃度，而反應(yīng)速度沒(méi)有明顯變化，表明該酶在細(xì)胞內(nèi)常處于被底物所飽和的狀態(tài)，底物濃度的微量變化不會(huì)引起反應(yīng)速度有意義的變化。
（3）、催化可逆反應(yīng)的酶
當(dāng)正、逆反應(yīng)Km值不同時(shí)，Km值小的底物所表示的反應(yīng)方向?yàn)樵撁复呋膬?yōu)勢(shì)方向。
（4）、多酶催化的連鎖反應(yīng)，確定各酶的Km可尋找代謝過(guò)程的限速酶，在底物濃度相似時(shí)，Km值大的酶為限速酶。
（5）、由于存在Km值不同而功能相同的酶，從而發(fā)現(xiàn)同工酶。
（6）、測(cè)定不同抑制劑對(duì)某個(gè)酶Km及Vm的影響，可區(qū)別該抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑還是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
（7）、測(cè)定不同菌株天冬酰胺酶對(duì)天冬酰胺的Km值。選用Km值較小的酶，可評(píng)價(jià)和篩選藥用酶。
Km和Vm的求取：
因酶促反應(yīng)的米氏方程有雙曲線(xiàn)特征，[S]對(duì)V作圖不能準(zhǔn)確獲得Vm和Km，所以常用雙倒數(shù)作圖法將此方程轉(zhuǎn)換成直線(xiàn)方程，有作圖的直線(xiàn)斜率、截距求得Km和Vm值。
（二）抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
1．抑制作用的分類(lèi)
酶分子與配體結(jié)合后常引起酶活性改變，使酶活性降低或完全喪失的配體稱(chēng)為抑制劑，這種效應(yīng)稱(chēng)抑制作用。
抑制作用分為不可抑制作用和可抑制作用兩大類(lèi)，不可抑制作用又分為專(zhuān)一性抑制和非專(zhuān)一性抑制；可抑制作用分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合性抑制。
2．不可抑制作用
抑制劑與酶分子上的必須基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，不能用透析、超濾等物理方法解除抑制，必須通過(guò)化學(xué)方法才能解除機(jī)宜作用，稱(chēng)不可抑制作用。抑制程度決定于抑制劑濃度及酶與抑制劑間的接觸時(shí)間。
專(zhuān)一性抑制劑是一些具有專(zhuān)一化學(xué)結(jié)構(gòu)并帶有一個(gè)活潑基團(tuán)的類(lèi)底物，與酶結(jié)合時(shí)活潑的化學(xué)基團(tuán)可與酶活性中心殘基或輔基發(fā)生共價(jià)修飾而使酶失活。
非專(zhuān)一抑制劑可對(duì)酶分子上每個(gè)結(jié)構(gòu)殘基進(jìn)行共價(jià)修飾而導(dǎo)致酶失活，這類(lèi)抑制劑主要是一些修飾氨基酸殘基的化學(xué)試劑及重金屬離子等。
（1）、有機(jī)磷化合物
神經(jīng)毒氣和有機(jī)磷農(nóng)藥通過(guò)與膽堿酯酶絲氨酸的羥基結(jié)合而破壞酶的活性中心，使酶喪失活性。由于乙酰膽堿的堆積而引起神經(jīng)癥狀。
有機(jī)磷化合物屬于不可逆抑制劑，可用含C-CH=NOH的肟化物將其從酶分子上取代下來(lái)，使酶恢復(fù)活性。常用做解毒劑，如解磷啶。
（2）、有機(jī)汞、砷化和物
這些化合物能與許多巰基酶的巰基結(jié)合而使酶活性喪失，如路易士氣、吡霜類(lèi)等。
這類(lèi)抑制劑對(duì)巰基酶的抑制作用可通過(guò)加入過(guò)量巰基化合物，如Cys、還原型谷胱甘肽、二巰基丙醇等使酶恢復(fù)活性。
巰基化合物常稱(chēng)為巰基酶的保護(hù)劑，被用做砷、汞等重金屬中毒的解毒劑。
（3）、重金屬離子
重金屬鹽類(lèi)Ag+、Hg+、Pb+等與酶的巰基、羥基、咪唑基結(jié)合，對(duì)大多數(shù)酶活性具有強(qiáng)烈抑制作用。
金屬離子螯合劑EDTA、Cys可解除其抑制，使酶恢復(fù)活性。
（4）、烷化劑
主要是含鹵素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰胺等，可使酶中的巰基烷化。從而使酶失活。常用做鑒定酶中巰基的特殊試劑。
（5）、氰化物
氰化物能與含鐵卟啉的酶中的Fe++結(jié)合，使酶失活而阻止細(xì)胞呼吸。
（6）、自由基對(duì)酶類(lèi)的作用
自由基是指能獨(dú)立存在的含有一個(gè)或幾個(gè)以上未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)、分子或離子。
由于具有未配對(duì)電子，所以其性質(zhì)不穩(wěn)定，有變?yōu)槌蓪?duì)電子的傾向，易發(fā)生失電子或得電子的氧化—還原反應(yīng)。
生物體內(nèi)最多的自由基是含氧自由基，如O2-.、OH.、O1/2.，生理?xiàng)l件下這些自由基不斷產(chǎn)生，不斷清除。過(guò)量自由基的產(chǎn)生可造成機(jī)體細(xì)胞非特異性氧化損傷，如引起DNA堿基修飾、鏈斷裂、酶蛋白變性失活等，從而產(chǎn)生多種病理過(guò)程。
自由基可攻擊酶活性部位的基團(tuán)使酶失活；使生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生氧化物，而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
機(jī)體的抗氧化防御體系包括抗氧化酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化劑?？寡趸钢饕荢OD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶等，可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物。
非酶類(lèi)抗氧化劑主要指VE、類(lèi)胡羅卜素、抗壞血酸等，主要是清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基。
3．可逆性抑制作用
抑制劑與酶非共價(jià)結(jié)合，用透析等物理方法可除去抑制劑使酶恢復(fù)活性。
（1）、競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用
抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似，可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合于酶的活性中心。酶不能同時(shí)和S和I結(jié)合。
（2）、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制
抑制劑與底物結(jié)構(gòu)不相似，不競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，而是和活性中心以外的部位結(jié)合，使酶的活性受到抑制。酶能同時(shí)和S、I結(jié)合形成EIS復(fù)合物。
非競(jìng)爭(zhēng)性抑制在生物體內(nèi)多表現(xiàn)為代謝中間產(chǎn)物反饋調(diào)控酶的活性。
（3）、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制
抑制劑只能與ES結(jié)合形成無(wú)活性的EIS三元復(fù)合物，而不能與游離的酶結(jié)合。
（4）、混合性抑制作用
主要表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的混合或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制與反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的混合。
（5）、可逆性抑制作用的應(yīng)用
I、磺胺類(lèi)藥物與抗菌增效劑
細(xì)菌在生長(zhǎng)時(shí)不能利用現(xiàn)成的葉酸，只能利用對(duì)氨基苯甲酸合成二氫葉酸，然后再轉(zhuǎn)化成四氫葉酸，參與核酸合成。
磺胺類(lèi)藥物與對(duì)氨基苯甲酸結(jié)構(gòu)相似，可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合細(xì)菌上午二氫葉酸合成酶，抑制二氫葉酸的合成，使核酸合成受阻，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
抗菌增效劑與二氫葉酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似，可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制二氫葉酸還原酶，使四氫葉酸合成受阻。
II、葉酸類(lèi)似物
葉酸類(lèi)似物，如氨基喋呤、氨甲喋呤可競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸還原酶，阻止葉酸還原成二氫葉酸和四氫葉酸，阻斷嘌呤核苷酸的合成而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
III、嘌呤類(lèi)似物
嘌呤類(lèi)似物主要是次黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的衍生物，可阻止次黃嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)化為AMP，干擾癌細(xì)胞核苷酸及蛋白質(zhì)的合成。
IV、嘧啶類(lèi)似物
與嘌呤類(lèi)似物作用相似，抑制癌細(xì)胞DNA合成，如抗癌藥物5-氟尿嘧啶。
V、氨基酸類(lèi)似物
如重氮絲氨酸、6-重氮-5-正亮氨酸，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)與谷氨酸相似，可與天然谷氨酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合氨基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)，從而抑制嘌呤核苷酸的合成，具有抑菌作用。
三、酶活性的調(diào)節(jié)
酶作為生物催化劑的特點(diǎn)：催化的高效性和專(zhuān)一性、反應(yīng)條件溫和、活性的可調(diào)節(jié)性。
動(dòng)物機(jī)體代謝調(diào)節(jié)的本質(zhì)是通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)進(jìn)行有效調(diào)節(jié)控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
酶的調(diào)節(jié)有兩個(gè)方面，一是對(duì)已有酶活性的調(diào)節(jié)，二是對(duì)酶的合成與降解的調(diào)節(jié)。
（一）別構(gòu)調(diào)節(jié)
代謝物分子（底物、中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物）不直接作用于酶的活性中心，而以非共價(jià)鍵結(jié)合活性中心以外的別構(gòu)部位，通過(guò)構(gòu)象的變化而改變酶的活性，這種調(diào)節(jié)稱(chēng)為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)或變構(gòu)調(diào)節(jié)。
此種酶稱(chēng)別構(gòu)酶或變構(gòu)酶，能使酶分子發(fā)生別構(gòu)的物質(zhì)稱(chēng)別構(gòu)效應(yīng)物或別構(gòu)效應(yīng)劑。能使酶活性增強(qiáng)的稱(chēng)別構(gòu)激活劑，反之稱(chēng)別構(gòu)抑制劑。
1．反饋調(diào)節(jié)
別構(gòu)調(diào)節(jié)是通過(guò)反饋方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的，如代謝終產(chǎn)物對(duì)原始酶的直接或間接的反饋抑制。
反饋可分為正反饋和負(fù)反饋兩種。正反饋使代謝過(guò)程加快或酶活性提高，稱(chēng)正反饋或反饋促進(jìn)；反之稱(chēng)負(fù)反饋或反饋抑制。
反饋調(diào)節(jié)是代謝調(diào)節(jié)中最廣泛最主要的機(jī)制，反饋調(diào)節(jié)還包括代謝途徑以外的任何因子對(duì)酶的特異調(diào)節(jié)。
（1）、反饋抑制的形式
單價(jià)反饋抑制：反應(yīng)過(guò)程是直接進(jìn)行的，不發(fā)生分支反應(yīng)，如長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì) 乙酰CoA羧化酶的反饋抑制。
B、多價(jià)反饋抑制：在分支途徑中兩個(gè)或兩個(gè)以上的終產(chǎn)物共同存在時(shí)，抑制共 同途徑的起始步驟的酶活性，但終產(chǎn)物單獨(dú)存在時(shí)不表現(xiàn)抑制作用。
C、協(xié)同反饋抑制：幾個(gè)終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量存在時(shí)可抑制其共同途徑的第一步驟酶活性，當(dāng)幾個(gè)終產(chǎn)物單獨(dú)過(guò)量存在時(shí)只抑制相應(yīng)分支途徑的酶活性。
D、順序反饋抑制：當(dāng)終產(chǎn)物E過(guò)量時(shí)，對(duì)EC抑制，此時(shí)中間產(chǎn)物C濃度增加，促進(jìn)反應(yīng)向G方向進(jìn)行，致使另一終產(chǎn)物G增加，此時(shí)由于G過(guò)量對(duì)Ed酶抑制，結(jié)果C又過(guò)剩，于是對(duì)酶Ea抑制，最后使A到B反應(yīng)減慢。
E、積累反饋抑制：幾個(gè)終產(chǎn)物中任何一個(gè)過(guò)量時(shí)都能對(duì)共同途徑的某一個(gè)酶產(chǎn)生部分抑制作用，各個(gè)抑制作用之間互不干擾，當(dāng)幾個(gè)終產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)它們的抑制作用是積累的。
（2）、反饋抑制的特征
是產(chǎn)物本身來(lái)控制產(chǎn)生自己的速度，是控制產(chǎn)物濃度最準(zhǔn)確、最經(jīng)濟(jì)的方式。
2．別構(gòu)酶與別構(gòu)效應(yīng)
別構(gòu)酶是由兩個(gè)以上亞基組成的寡聚體，在結(jié)構(gòu)上有明確的調(diào)節(jié)部位和催化部位，兩個(gè)部位可在同一個(gè)亞基上，也可分別位于不同的亞基上，彼此能相互影響產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。底物和別構(gòu)劑能各自專(zhuān)一地與同一酶結(jié)合，別構(gòu)劑結(jié)合在別構(gòu)部位，結(jié)合后調(diào)節(jié)部位和催化部位發(fā)生構(gòu)象改變，主要指亞基間嚴(yán)緊型與松弛型間的轉(zhuǎn)變。
別構(gòu)酶底物具有協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)配體（底物與小分子效應(yīng)劑）與酶蛋白結(jié)合后，影響另一配體和酶蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致酶催化活性的改變。這種效應(yīng)稱(chēng)協(xié)同效應(yīng)。協(xié)同效應(yīng)是多亞基別構(gòu)酶的基本特征。
根據(jù)兩個(gè)配體是否相同和影響是促進(jìn)還是減慢協(xié)同效應(yīng)分為同促和異促、正協(xié)同和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。
別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)特征與調(diào)節(jié)：
別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)不服從米氏方程，酶反應(yīng)初速度與底物濃度不是矩形雙曲線(xiàn)，而是呈S形曲線(xiàn)。
別構(gòu)酶的S形曲線(xiàn)表明，對(duì)別構(gòu)酶來(lái)說(shuō)酶反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化極為敏感。因此在細(xì)胞內(nèi)當(dāng)?shù)孜锇l(fā)生很小變化時(shí)別構(gòu)酶可以極大程度地調(diào)節(jié)反應(yīng)速度。
3．別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)理
（1）、MWC模式——能反映正協(xié)同效應(yīng)
別構(gòu)酶是由兩個(gè)以上亞基組成的寡聚酶，各亞基占有相等的、物理位置相對(duì)稱(chēng)的排列。
每個(gè)亞基對(duì)一種配體只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
每種亞基都以松弛型和嚴(yán)緊型兩種構(gòu)象狀態(tài)存在，并保持平衡。
兩種構(gòu)象狀態(tài)可以互變，構(gòu)象轉(zhuǎn)變采取同步協(xié)同方式。
構(gòu)象狀態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)分子對(duì)稱(chēng)性不變。
多個(gè)配體結(jié)合到酶的特異結(jié)合部位上，各個(gè)配體與R型和T型結(jié)合的位點(diǎn)都相等。
（2）、KNF模式——正負(fù)協(xié)同效應(yīng)
A、當(dāng)配體不存在時(shí)別構(gòu)酶只有T型一種構(gòu)象狀態(tài)存在，而不處于R、T的平衡狀態(tài)；只有當(dāng)配體與之結(jié)合后，才誘導(dǎo)T型向R型轉(zhuǎn)變。
B、構(gòu)象改變是序變方式進(jìn)行的，而不是齊變。當(dāng)配體與第一個(gè)亞基結(jié)合引起該亞基構(gòu)象變化，并導(dǎo)致鄰近其他亞基發(fā)生構(gòu)象改變。
C、亞基間的相互作用可能是正協(xié)同效應(yīng)，也可能是負(fù)協(xié)同效應(yīng)。
4．別構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義
同促效應(yīng)是對(duì)底物濃度改變作出的調(diào)節(jié)效應(yīng)。
同促正協(xié)同效應(yīng)時(shí)酶具有S型動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，對(duì)較小的底物濃度變化，酶反應(yīng)能作出靈敏的應(yīng)答，在代謝途徑中只有關(guān)鍵地位的酶調(diào)節(jié)具有重要生理意義。
同促負(fù)協(xié)同效應(yīng)時(shí)酶具有表觀雙曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，反應(yīng)速度對(duì)底物濃度的變化相對(duì)不敏感，這一特點(diǎn)對(duì)體內(nèi)那些和條代謝途徑有聯(lián)系的酶來(lái)說(shuō)，可保證其能穩(wěn)定正常地工作。
（二）酶的化學(xué)修飾
酶蛋白肽鏈上某些殘基，在另一種酶的催化下發(fā)生可逆共價(jià)修飾，而引起酶活性改變的過(guò)程，稱(chēng)酶的化學(xué)修飾。
酶的化學(xué)修飾包括：磷酸化與脫磷酸化，乙?；c脫乙?；?，腺苷化與脫腺苷化，-SH與-S-S-互變，尿苷酰化與脫尿苷?；?，ADP-核糖基化，甲基化與脫甲基化等。其中磷酸化與脫磷酸化在代謝調(diào)節(jié)中最為重要和常見(jiàn)。
蛋白激酶催化磷酸化，特異的磷酸酶催化脫磷酸。被修飾的酶在活性形式與非活性形式之間互相轉(zhuǎn)變。通過(guò)共價(jià)修飾改變酶的構(gòu)象，調(diào)節(jié)酶的活性。
化學(xué)修飾的特點(diǎn)及意義：
（1）、絕大多數(shù)修飾調(diào)節(jié)酶具有無(wú)活性與有活性?xún)煞N形式，它們互變反應(yīng)中正逆兩個(gè)方向由不同的酶催化。
（2）、此種酶促反應(yīng)是級(jí)聯(lián)反應(yīng)，修飾因子使第一個(gè)酶發(fā)生酶促共價(jià)修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子發(fā)生共價(jià)修飾，每修飾一次，就可將調(diào)節(jié)因子的信號(hào)放大一次。
（3）、磷酸化是最常見(jiàn)的酶促共價(jià)修飾反應(yīng)，是生物體調(diào)節(jié)酶活性經(jīng)濟(jì)而有效的方式。
（4）、化學(xué)修飾調(diào)節(jié)常與別構(gòu)調(diào)節(jié)相互協(xié)作，增強(qiáng)了調(diào)節(jié)因子的作用。別構(gòu)調(diào)節(jié)是細(xì)胞的基本調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)維持代謝和能量平衡很重要。但當(dāng)別構(gòu)效應(yīng)劑濃度很低時(shí)而不能發(fā)揮足夠的調(diào)節(jié)作用，即可通過(guò)化學(xué)修飾反應(yīng) ，引起有效酶活性的迅速改變和相應(yīng)的生理反應(yīng)。
（5）、酶的化學(xué)修飾是生物體內(nèi)快速而普遍的調(diào)節(jié)方式，對(duì)糖代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育、基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放有主要作用。
（三）限制性蛋白水解對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)
限制性蛋白水解是一種不可逆且高特異性的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)系統(tǒng)，如酶原的激活、血液凝固、補(bǔ)體激活等，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起著切除、修飾和加工等重要作用。
調(diào)節(jié)的特點(diǎn)：
（1）、受這種調(diào)節(jié)的酶都以酶原形式合成和分泌，當(dāng)需要時(shí)被相應(yīng)的蛋白酶切除小肽鏈而激活。
（2）、由酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槊甘遣豢赡娴摹?br>
（3）、激活過(guò)程顯示協(xié)同級(jí)聯(lián)、快速的放大效應(yīng)。
（4）、被激活的酶在完成其特定功能后，能及時(shí)地從靶部位被解除。
（5）、受這種調(diào)節(jié)的酶主要是一些消化酶和執(zhí)行防御功能的酶。
四、核酶的催化作用
核酶是由Cech和Altman（1989年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）1982年提出的，具有催化作用的mRNA。
一）、概述（與蛋白質(zhì)酶相比較）
（1）、化學(xué)本質(zhì)：是RNA，其催化活性及催化特異性都為其結(jié)構(gòu)和特性所決定。由A、C、G、U四種堿基組成，以堿基互補(bǔ)方式與底物結(jié)合。
（2）、底物：主要為RNA。
（3）、反應(yīng)特異性：具有嚴(yán)格的堿基特異性。
（4）、催化效率：催化效率較低。
（5）、產(chǎn)物：集底物、產(chǎn)物于一身。
（60、在生命活動(dòng)中起重要作用。
2、核酶的分類(lèi)
（1）、根據(jù)催化反應(yīng)的種類(lèi)分為四類(lèi)：I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接
II類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接
自身催化的剪切型
異體催化的剪切型
（2）、作用機(jī)制：I、剪接型：催化自身剪接，具有內(nèi)切酶和連接酶兩種活性。
II、剪切型：催化自身RNA或異體RNA一段RNA的剪除，具有內(nèi)切酶活性。
（3）、作用底物：I、自身催化：以自身為底物進(jìn)行自我剪切和剪接。
II、異體催化；以異體為底物。
二）、剪接型核酶
其作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的方式除去內(nèi)含子或居間序列，連接外顯子，生成成熟RNA。
內(nèi)含子是各種RNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物前體待剪接序列。
1、內(nèi)含子的自我剪接：存在于真核細(xì)胞一些RNA前體。
（1）、剪接機(jī)制
rRNA前體中內(nèi)含子的環(huán)化。
第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：鳥(niǎo)苷化合物中G的3’-OH作為親核基團(tuán)向5’外顯子與內(nèi)含子5’剪接點(diǎn)的磷酸酯鍵進(jìn)行親核攻擊，5’外顯子脫落，3’外顯子與內(nèi)含子相連。
第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)：5’外顯子的3’-OH作為親核基團(tuán)攻擊3’外顯子與內(nèi)含子的3’剪接點(diǎn)連接的磷酸酯鍵，形成新的磷酸二酯鍵，而外顯子相連生成rRNA，同時(shí)釋放內(nèi)含子。
L-19內(nèi)含子的形成：釋放的IVS可進(jìn)行自身環(huán)化，即線(xiàn)性?xún)?nèi)含子的3’—OH攻擊其5’端的磷酸二酯鍵，從5’端脫下15個(gè)核苷酸片段，并連接為環(huán)狀中間產(chǎn)物，開(kāi)環(huán)后再剪切下4個(gè)核苷酸，最后得到一個(gè)丟失19個(gè)核苷酸的線(xiàn)性IVS，即L-19 IVS。L-19內(nèi)含子具有多種酶的活性，可催化多種以RNA為底物的反應(yīng)，如核苷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)、磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)、RNA限制性?xún)?nèi)切反應(yīng)等。
（2）I類(lèi)內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)
包括P1-P10的堿基對(duì)區(qū)，P、Q、R、S序列，突環(huán)、單鏈區(qū)，剪接位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)。不同的I類(lèi)內(nèi)含子序列的相似性很小，但都有一系列短的保守序列，P/Q，R/S配對(duì)區(qū)和P、Q、R、S未配對(duì)序列，在P1和P10處有5’端和3’端剪接位點(diǎn)，由IGS堿基對(duì)組成。G結(jié)合位點(diǎn)主要成分是在P9的G-C堿基對(duì)。
2、II類(lèi)內(nèi)含子的剪接：II類(lèi)內(nèi)含子存在于植物的線(xiàn)粒體、葉綠體及真菌中。
（1）、剪切機(jī)制
套環(huán)形成：內(nèi)含子中位于3’剪接位點(diǎn)的餓一個(gè)A的2’-OH作為親核基團(tuán)對(duì)5’剪接位點(diǎn)的磷酸酯鍵進(jìn)行親核攻擊，使5’剪接位點(diǎn)斷開(kāi)。由2’,5’-磷酸二酯鍵連接形成套環(huán)結(jié)構(gòu)。
外顯子連接：5’外顯子的3’-OH作為親核基團(tuán)對(duì)內(nèi)含子3’剪接位點(diǎn)進(jìn)行親核攻擊，兩個(gè)外顯子以3’,5’-磷酸二酯鍵相連，形成成熟的RNA，并釋放帶有套環(huán)的內(nèi)含子。
（2）、II類(lèi)內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)
II類(lèi)內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu)由6個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。結(jié)構(gòu)域I有兩個(gè)保守的外顯子結(jié)構(gòu)序列，分別與兩個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)序列相互配對(duì)，有5’和3’端邊界序列GUGYG和AY。結(jié)構(gòu)域V高度保守，為催化活性所必需，并與結(jié)構(gòu)域I結(jié)合，形成催化核心。結(jié)構(gòu)域VI是一個(gè)含有套環(huán)分支點(diǎn)的螺旋結(jié)構(gòu)。
三）、剪切型核酶
1、自身催化剪切型RNA
（1）、錘頭結(jié)構(gòu)
由三個(gè)雙螺旋區(qū)包括有13個(gè)核苷酸殘基是保守序列的中心區(qū)或核心結(jié)構(gòu)，及連接堿基對(duì)的任意發(fā)夾環(huán)組成。由催化部分和底物部分組成。
（2）、發(fā)夾結(jié)構(gòu)
由4個(gè)螺旋區(qū)和數(shù)個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)組成。螺旋區(qū)有6個(gè)堿基對(duì)組成，II由4個(gè)堿基對(duì)組成，III由5個(gè)堿基對(duì)組成，IV有5個(gè)堿基對(duì)的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，需要有3對(duì)配對(duì)堿基存在，有兩個(gè)內(nèi)部環(huán)將I、II區(qū)與III、IV區(qū)分開(kāi)。剪切位點(diǎn)有5個(gè)堿基組成，GUG是最常見(jiàn)的剪切部位，剪切反應(yīng)發(fā)生在GUG的5’端。
（3）、斧頭結(jié)構(gòu)——人肝炎病毒HDV
有三個(gè)堿基對(duì)的莖（I、II、III），在III處有一個(gè)單鏈的RNA開(kāi)放區(qū)。莖II發(fā)夾環(huán)處起分為酶及底物部分。
2、異體催化剪切型
核糖核酸酶P（RNase P）是內(nèi)切核酸酶，能剪切所有的tRNA前體。
RNase P由M1 RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。單獨(dú)的M1 RNA具有催化活性，但單獨(dú)的蛋白質(zhì)則不具有催化活性。
第三講 核酸化學(xué)
一、核酸的結(jié)構(gòu)
（一）DNA的結(jié)構(gòu)
1．DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)
動(dòng)物染色質(zhì)DNA是雙螺旋線(xiàn)型。線(xiàn)粒體、細(xì)菌及某些病毒是雙螺旋環(huán)狀。少數(shù)幾種病毒是單鏈線(xiàn)型或環(huán)狀。
DNA主要由A、G、C、T和少量稀有堿基如m5C組成。各種生物堿基組成規(guī)律：
腺嘌呤與胸腺嘧啶完全相等。G與C完全相等。嘌呤總數(shù)與嘧啶總數(shù)完全相等。A+C=G+T A/T=G/C。
堿基組成具有種的特異性，既不同的物種DNA具有自己獨(dú)特的堿基組成。
堿基組成不具有組織器官特異性，同一生物各組織器官具有相同的堿基組成。
年齡、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)不影響DNA堿基組成。
DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸按一定的方式、數(shù)量、排列順序形成的多核苷酸鏈。
一個(gè)脫氧核苷酸的C3’-OH與一個(gè)C5’-P以3’—5’磷酸二酯鍵相連形成糖-磷酸骨架，堿基在內(nèi)側(cè)，3’端為-OH，5’端為-P，書(shū)寫(xiě)時(shí)按5’→3’方向。書(shū)寫(xiě)用縮寫(xiě)式如dACGT或5’ dACGT3’等，表式脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)。
真核生物DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)中，常有一些重復(fù)序列。
①高重復(fù)序列： 重復(fù)頻率高，從幾十萬(wàn)次到幾百萬(wàn)次，重復(fù)序列較短，5~300bp，多數(shù)為5~15bp。重復(fù)序列中有些是反向重復(fù)序列，即該片段堿基順序在互補(bǔ)鏈方向正讀反讀都相同，稱(chēng)回文結(jié)構(gòu)。
有些反向重復(fù)序列中間被一些不相關(guān)的順序隔開(kāi)，形成十字形結(jié)構(gòu)，在十字形兩頭形成發(fā)夾環(huán)。
高重復(fù)序列中還有一種由簡(jiǎn)單重復(fù)單位組成的重復(fù)序列，重復(fù)單位由2~10 bp，成串排列。
高重復(fù)序列堿基組成不同于其它部分，可用等密度梯度離心法將其與主體部分分開(kāi)，稱(chēng)為衛(wèi)星DNA。根據(jù)重復(fù)頻率和重復(fù)序列長(zhǎng)度不同又分為小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。衛(wèi)星DNA是一種較好的分子遺傳標(biāo)記。
高重復(fù)序列可參與DNA復(fù)制及基因表達(dá)調(diào)控。
②中重復(fù)序列：重復(fù)頻率和序列長(zhǎng)度有很大差異，平均長(zhǎng)度為6×105bp，平均重復(fù)350次，在DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)中可成串的排列在一個(gè)大的區(qū)域，也有的與單拷貝序列間隔排列，有些序列不編碼蛋白質(zhì)，有些序列編碼蛋白質(zhì)。
中重復(fù)序列具有種的特異性，可作為探針區(qū)分不同種哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA。
③低重復(fù)序列——單拷貝序列
序列不重復(fù)或只重復(fù)幾次、十幾次，長(zhǎng)度大于1000bp，攜帶大量遺傳信息，編碼多種蛋白質(zhì)，有的是基因間隔序列。
2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是Waston和Crick于1953年提出的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。其要點(diǎn)如下：
①主鏈：有兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈組成。雙鏈圍繞螺旋軸以右手方向盤(pán)繞成雙螺旋。磷酸-脫氧核糖位于螺旋的外側(cè)，構(gòu)成螺旋的主鏈，堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)。
②堿基對(duì)：兩條鏈的堿基通過(guò)氫鍵聯(lián)系在同一平面上形成堿基對(duì)，A--T,G--C。兩種堿基對(duì)氫鍵間的距離、堿基兩側(cè)與其C-1’連接之間距離及C-1’與核苷酸構(gòu)成的角度相同。
③螺距：雙螺旋螺距為3.4nm，包含10個(gè)堿基對(duì)。每?jī)蓚€(gè)相鄰堿基平面的垂直距離為0.34nm，直徑為2.0nm 。相鄰堿基對(duì)之間的螺旋角度為36°。
④大溝和小溝：兩條主鏈和堿基并不充滿(mǎn)雙螺旋的空間，表面形成大小兩條凹下去的槽，稱(chēng)大溝和小溝。這是由于堿基對(duì)上下大小不同及堿基對(duì)兩側(cè)的脫氧核糖是不對(duì)稱(chēng)的而形成的。兩種溝內(nèi)都具有形成氫鍵的氫供體和受體，但結(jié)構(gòu)不同。大溝比小溝寬而深，易與DNA蛋白質(zhì)酶等相互作用。
這種模型為B-DNA，隨著DNA分析技術(shù)的發(fā)展，DNA的雙螺旋不是均勻的，整個(gè)螺旋不是垂直而是彎曲的，許多結(jié)構(gòu)參數(shù)是隨堿基序列的不同而有一定范圍的波動(dòng)，如旋轉(zhuǎn)角度等。
穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素有：互補(bǔ)堿基間氫鍵，堿基堆積力（堿基平面之間的范德華力和疏水作用力），離子鍵（外側(cè)磷酸基的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子之間形成的離子鍵）。
DNA雙螺旋的多態(tài)性：
DNA在不同條件下存在有不同的雙螺旋結(jié)構(gòu)，具有多態(tài)性。如：A、A’、B、B’、C、C’、D、E、Z等。
①A-DNA：
DNA纖維鈉鹽在濕度為75%時(shí)，B-DNA轉(zhuǎn)變?yōu)锳-DNA。
A-DNA的右手螺旋比B-DNA大且較平，每轉(zhuǎn)一圈的螺距為2.8nm，每一圈的堿基對(duì)數(shù)為11，堿基距離0.255nm，堿基旋轉(zhuǎn)33°。堿基平面與中心軸不垂直，而成20°傾斜，大溝窄而深小溝淺。
②Z-DNA
結(jié)構(gòu)特征：
a：以二聚體dGC或dCG為一個(gè)單位，由六個(gè)這樣的單位構(gòu)成一個(gè)左手螺旋。磷酸基團(tuán)走向成Z型。螺旋直徑為1.8nm。每轉(zhuǎn)一圈包括12個(gè)堿基對(duì)，螺距為4.5nm。
b：G--C堿基對(duì)不是對(duì)稱(chēng)的位于螺旋軸附近移向邊緣，G位于DNA分子表面成六面對(duì)稱(chēng)排布，表面有窄而深的小溝。
影響Z-DNA形成與穩(wěn)定的因素：
①單價(jià)、二價(jià)金屬離子有利于Z-DNA的形成與穩(wěn)定。多胺等促進(jìn)Z-DNA的形成與穩(wěn)定。
②具有嘧啶、嘌呤交替相間的序列有利于Z-DNA的形成。
③胞嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤的甲基化可形成穩(wěn)定的Z-DNA。
④組蛋白H2A、H2B、H3、H4穩(wěn)定Z-DNA而組蛋白H1和H5不利于Z-DNA的形成。
⑤在有適當(dāng)堿基序列的部位解旋時(shí)，促進(jìn)Z-DNA的形成。
三螺旋DNA的結(jié)構(gòu)分為分子間、分子內(nèi)、和平行三螺旋DNA三類(lèi)
三螺旋DNA的結(jié)構(gòu)分為分子間、分子內(nèi)、和平行三螺旋DNA三類(lèi).
①堿基組成及配對(duì)：
三螺旋是在雙螺旋的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的
三鏈區(qū)的三條鏈均由同型嘌呤或同型嘧啶組成。根據(jù)堿基組成及結(jié)構(gòu)的不同分為嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Y。RY型）：TAT、CGC，嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R。RY型）：AAT、GGC。堿基配對(duì)方式，第三個(gè)堿基以A--T、G--C配對(duì)只形成兩對(duì)氫鍵，在R。RY型上還存在G--G、A--A每一型中堿基配對(duì)具有高度的序列特異性。
②分子間三螺旋DNA：
合成的脫氧多核苷酸在一定條件下DNA雙螺旋的特定區(qū)插入雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝內(nèi)，通過(guò)氫鍵的形成局部的分子間三螺旋結(jié)構(gòu)，并與雙螺旋一起旋轉(zhuǎn)。
③分子內(nèi)三螺旋DNA：
DNA雙螺旋特定區(qū)通過(guò)氫鍵作用發(fā)生自身折疊形成局部分子內(nèi)三股螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)游離出一段DNA單鏈。如H-DNA，其內(nèi)的主要序列成為H-回文序列。
④平行的三螺旋結(jié)構(gòu)：
三螺旋結(jié)構(gòu)中的第三條鏈的序列，方向與第一條鏈的相同稱(chēng)為R-DNA。
近年來(lái)的研究表明，在真核細(xì)胞染色質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)許多基因的調(diào)控區(qū)和染色質(zhì)的重組部位含有三螺旋DNA結(jié)構(gòu)，應(yīng)用單鏈DNA片段可將切割劑攜帶到DNA的特定位點(diǎn)，從而達(dá)到選擇性切斷有害基因或病毒基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)三螺旋DNA的研究有助于認(rèn)識(shí)真核基因結(jié)構(gòu)，復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和重組的機(jī)理。
3、DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)
DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤(pán)繞所形成的構(gòu)象。包括線(xiàn)型雙鏈中的扭結(jié)、超螺旋、多重螺旋、分子內(nèi)局部單鏈環(huán)、連環(huán)等。超螺旋是最常見(jiàn)的一種。
①超螺旋
環(huán)狀DNA、線(xiàn)形雙螺旋兩端連接進(jìn)一步扭曲可形成負(fù)超螺旋。向右手扭曲形成正超螺旋。
天然存在的超螺旋多為負(fù)超螺旋。如細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、大腸桿菌染色體DNA、真核細(xì)胞染色體DNA的。
自然界中大多數(shù)DNA分子都以超螺旋結(jié)構(gòu)存在。其意義在于：1、密度大、體積小，在細(xì)胞中所有體積較為經(jīng)濟(jì)；2、能影響雙螺旋的解鏈程度，因而影響DNA分子與其他分子的相互作用，參與DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等功能。
（2）染色體DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)
真核細(xì)胞染色體DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是線(xiàn)性雙螺旋，三級(jí)結(jié)構(gòu)是雙螺旋盤(pán)繞在組蛋白上的負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)。這種以組蛋白為核心，盤(pán)繞以DNA片段的顆粒稱(chēng)核小體。
核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，每一個(gè)核小體上的DNA熟練是因生物種類(lèi)和組織不同而異。完整的核小體由核小體核心與連接蛋白組成，核心是由組蛋白H2A/H2B、H3/H4與DNA結(jié)合形成的八聚體，連接蛋白由組蛋白H1和20-80bp的DNA構(gòu)成。許多核小體形成念珠線(xiàn)形結(jié)構(gòu)的核小體鏈，然后盤(pán)繞形成染色質(zhì)纖維，再進(jìn)行盤(pán)曲形成染色單體。
線(xiàn)粒體DNA的結(jié)構(gòu)
線(xiàn)粒體DNA是雙鏈環(huán)狀分子，兩個(gè)鏈的堿基組成顯著不同。重鏈含有較多的G，輕鏈含有較多的C。有一個(gè)長(zhǎng)度不同的D環(huán)。D環(huán)含有2個(gè)啟動(dòng)基因（P1、P2），3個(gè)保守序列CSB（I、II、III）和一個(gè)終止序列；有2個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（OH、OL）；重鏈?zhǔn)?種Rrna、14種Trna和12種多肽的模板，輕鏈?zhǔn)?種Trna和1種多肽的模板。線(xiàn)粒體基因排列緊密，沒(méi)有間隔區(qū)，基因長(zhǎng)度變化小，兩端不存在非編碼序列，很少有重復(fù)序列，無(wú)內(nèi)含子。
4、DNA的理化特性。
①分子大?。悍肿恿?04~107，堿基對(duì)107bp。長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)厘米，由于分子很長(zhǎng)，有一定脆性，極易受剪切力的作用而折斷。
②紫外吸收特性：由于嘌呤和嘧啶堿基形成共軛雙鏈而具有紫外吸收性質(zhì)，最大吸收波長(zhǎng)260nm，此特性可用于測(cè)量核酸的濃度及其純度。
③變性與復(fù)性：
變性：能破壞氫鍵和疏水鍵的因素都能導(dǎo)致雙螺旋的破壞。
變性因素：加熱、極端pH、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺等。
DNA由雙螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無(wú)規(guī)則卷曲單鏈，稱(chēng)DNA變性。變性理化性質(zhì)發(fā)生很大變化，260nm處紫外吸收值增高、黏度下降、沉降系數(shù)增加、浮力密度上升等。
熱變性在較窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，引起DNA變性溫度稱(chēng)熔點(diǎn)（Tm）。DNA Tm在70~85度之間。
溶液離子種類(lèi)和強(qiáng)度影響DNA的穩(wěn)定性，離子強(qiáng)度低時(shí)，Tm值低，熔點(diǎn)范圍較窄；離子強(qiáng)度高時(shí) ，熔點(diǎn)范圍較寬。
DNA分子堿基組成的均一性和分子中G+C的含量可影響其Tm 值。均一性DNA Tm值較窄，非均一性DNA Tm值較寬。G+C含量高的DNA，Tm值較高。亦較穩(wěn)定，所以，Tm值可作為測(cè)定DNA樣品均一性的指標(biāo)，及推算DNA堿基組成。
復(fù)性：
除去變性因素后，變性DNA的兩條鏈重新結(jié)合起來(lái)，恢復(fù)到原來(lái)雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱(chēng)為DNA復(fù)性。
復(fù)性后DNA的一系列理化性質(zhì)得到恢復(fù)，真核DNA重復(fù)頻率高的序列復(fù)性速度快，重復(fù)頻率低的則慢。序列簡(jiǎn)單、濃度高、片段大的DNA復(fù)性快。
（4）核酸分子雜交：
相同或不同來(lái)源的兩個(gè)DNA或DNA和RNA分子如果含有彼此互補(bǔ)的序列，混合在一起，通過(guò)變性和復(fù)性處理，DNA-DNA同源序列間及DNA-RNA異源序列間形成DNA-DNA或DNA-RNA雜交體，稱(chēng)為核酸分子雜交。
核酸探針（基因探針）：有目的合成從基因組中分離一段已知序列的DNA，使帶上標(biāo)記，竟變性后成為單鏈，在一定條件下與待測(cè)DNA單鏈雜交，如兩序列有同源性即互補(bǔ)，形成帶有標(biāo)記的雙鏈DNA分子，以達(dá)到探測(cè)位知DNA的目的。
（二）RNA結(jié)構(gòu)
1．RNA的結(jié)構(gòu)特征
（1）堿基組成：A、G、C、U及少量稀有堿基，堿基含量沒(méi)有A--U、G--C的比例關(guān)系。
（2）一級(jí)結(jié)構(gòu)：四種單核苷酸按一定方式、數(shù)量和排列順序形成多核苷酸鏈稱(chēng)為RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞RNA分子一般為線(xiàn)形單鏈分子。
（3）RNA構(gòu)象：RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)由雙螺旋或堿基對(duì)區(qū)、內(nèi)部環(huán)、單堿基突起和突環(huán)、發(fā)夾環(huán)或多分支環(huán)、單鏈區(qū)、甲結(jié)構(gòu)成。
雙螺旋區(qū)：RNA單鏈迂回折疊形成，一個(gè)或數(shù)個(gè)長(zhǎng)短不一的局部雙螺旋結(jié)構(gòu)。
內(nèi)部環(huán)：RNA鏈中不互補(bǔ)的堿基突出形成環(huán)狀突起。內(nèi)部環(huán)的堿基數(shù)目可以是對(duì)稱(chēng)的也可以是不對(duì)稱(chēng)的。
單堿基突起：在一個(gè)連續(xù)的雙螺旋中突起一個(gè)堿基。
發(fā)夾環(huán)：對(duì)于雙螺旋末端兩面連接的雙鏈區(qū)域，類(lèi)似發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
多分支環(huán)：是連接三個(gè)以上螺旋的環(huán)區(qū)。
甲結(jié)：是二級(jí)結(jié)構(gòu)中環(huán)區(qū)再加上堿基配對(duì)形成。是幾個(gè)螺旋區(qū)交叉的一種形式。
單鏈區(qū)：位于RNA分子的端部。
（4）RNA的空間結(jié)構(gòu)：
單鏈RNA分子通過(guò)折疊形成二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)既有單鏈區(qū)又有雙鏈區(qū)。種類(lèi)和功能不同的RNA有其特征的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，種類(lèi)和功能相同的RNA二級(jí)或三級(jí)相同或相似。
2．mRNA
二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有共同的形態(tài)和規(guī)律。原核生物和真核生物mRNA結(jié)構(gòu)不同。
（1）原核生物mRNA的結(jié)構(gòu)。
典型的多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)即一個(gè)操縱子編碼的幾條多肽鏈。5’端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，沒(méi)有修飾核苷酸，不含稀有堿基，3’端沒(méi)有多聚A序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)存在豐富的自身回折形成的雙鏈區(qū)，有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
（2）真核生物mRNA結(jié)構(gòu)
含有少量稀有堿基，由5’的帽子結(jié)構(gòu)、5’非編碼區(qū)、編碼區(qū)、3’非編碼區(qū)和3’多聚A尾組成。
①5’帽子結(jié)構(gòu)：是5’存在甲基化核苷，即：m7GpppNm.，對(duì)mRNA的翻譯活性很重要。
②3’多聚A結(jié)構(gòu)：存在于3’端的多聚A結(jié)構(gòu)，是轉(zhuǎn)錄后由腺苷酸聚合酶催化加上的，對(duì)mRNA的穩(wěn)定、翻譯效率有調(diào)控作用。
③編碼區(qū)：帶有特異性蛋白質(zhì)遺傳信息的翻譯區(qū)，是肽鏈氨基酸序列的編碼序列。
④非編碼區(qū)：存在5’和3’端，兩個(gè)非編碼區(qū)分別包括5’帽子結(jié)構(gòu)、起始密碼和終止密碼、多聚A結(jié)構(gòu)，非編碼區(qū)參與翻譯過(guò)程和起調(diào)控作用。
3．tRNA
（1）tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)特征
①單鏈小分子
②含有較多的稀有堿基或修飾堿基，其中以甲基化堿基較多；
③3’端都是…CCA-OH結(jié)構(gòu)；
④5’端總是磷酸化的，大多數(shù)為小pG；
⑤表現(xiàn)出進(jìn)化的保守性，有二十多個(gè)位點(diǎn)上的核苷酸是不變的；
⑥大多數(shù)tRNA第54到57位存在TΨCG序列。
（2）tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)
是三葉草結(jié)構(gòu)，有5個(gè)臂組成 ，即：氨基酸臂、二氫尿嘧啶臂、反密碼子臂、胸苷假尿苷胞苷臂和可變臂。每個(gè)臂由兩部分組成，一部分堿基配對(duì)形成雙螺旋，另一部分以單鏈形式形成一個(gè)小環(huán)。①氨基酸臂：由7個(gè)堿基對(duì)組成的局部雙螺旋區(qū)和3’端CCA-OH組成，可接受活化的氨基酸。
②二氫尿嘧啶臂由三個(gè)堿基對(duì)組成，短雙螺旋區(qū)和由7到10個(gè)核苷酸形成的二氫尿嘧啶環(huán)。
③反密碼子臂：由5個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的短雙螺旋區(qū)和7個(gè)核苷酸形成的反密碼子環(huán)，其中三個(gè)核苷酸組成反密碼子，與Mrna相應(yīng)的密碼子互補(bǔ)。
④胸苷甲尿苷胞苷臂：由5對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)和7個(gè)核苷酸圍成的TΨCG組成。TΨCG環(huán)使Trna與腺粒體的大亞基相互結(jié)合。
⑤可變臂：有3到21個(gè)核苷酸組成的可變化的含量多者可形成小雙螺旋。
5．hnRNA、snRNA、snoRNA
（1）hnRNA
又稱(chēng)不均一核RNA存在于真核生物細(xì)胞核中，分子量不均一，是mRNA的前體，在核質(zhì)中由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而成，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不含5’帽子和3’polyA結(jié)構(gòu)。在核質(zhì)量經(jīng)過(guò)加工修飾成有帽尾結(jié)構(gòu)的hnRNA，再經(jīng)剪接和甲基化修飾轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA.
hnRNA與蛋白體、結(jié)合成核內(nèi)不均一的核糖核蛋白顆粒（hnRNP），參與mRNA剪接加工成熟過(guò)程。
（2）snRNA
又稱(chēng)作核內(nèi)小RNA，是一類(lèi)小分子RNA，分布于細(xì)胞核中，與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成小分子細(xì)胞核核蛋白顆粒（snRNA），與Mrna前體組成剪接體，參與Mrna的剪切，加工。
（3）snoRNA
又稱(chēng)作小分子核仁RNA，存在于真核生物細(xì)胞核內(nèi)，參與Rrna的加工，影響Rrna，及其前體的形成等。
6．反義RNA
指能與有義mRNA互補(bǔ)結(jié)合的單鏈RNA。廣泛存在于自然界。原核生物由反義基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)。真核生物來(lái)自于mRNA同一DNA區(qū)。即由反鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)。
反義RNA是生物體內(nèi)重要的調(diào)控物質(zhì)，可在多層次對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
二 DNA的復(fù)制
（一）DNA復(fù)制過(guò)程基本要點(diǎn)
1．半保留復(fù)制
復(fù)制過(guò)程中，DNA兩條鏈分開(kāi)，分別以每一條鏈為模板合成新的互補(bǔ)鏈，產(chǎn)生兩個(gè)與原來(lái)DNA分子堿基順序完全一樣的子代DNA分子，每個(gè)子代DNA分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱(chēng)半保留復(fù)制。
1958年Meselson and Stahl用14NH4CL為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)證實(shí)了半保留復(fù)制。
半保留復(fù)制是雙鏈DNA的普遍復(fù)制機(jī)制。單鏈DNA在復(fù)制時(shí)，也要先形成雙鏈的復(fù)制形式。
2．復(fù)制的起始點(diǎn)、方向和方式
復(fù)制是從DNA分子上特定位置開(kāi)始的。這一位置稱(chēng)復(fù)制原點(diǎn)。方向大多以雙向進(jìn)行，也有一些以單向進(jìn)行。復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)叫復(fù)制叉，雙向復(fù)制可形成兩個(gè)復(fù)制叉。
（1） 復(fù)制的起始點(diǎn)
原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)，真核生物有幾個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。其共同特點(diǎn)是都富含A.T序列。是引發(fā)復(fù)制的蛋白因子結(jié)合的位點(diǎn)。不同生物中A.T序列長(zhǎng)度不同。
（2） 復(fù)制的方向
復(fù)制從特定位置開(kāi)始，大都雙向進(jìn)行，也有一些是單向的。向一側(cè)單方向進(jìn)行的復(fù)制稱(chēng)為單方向復(fù)制，向兩側(cè)進(jìn)行的復(fù)制叫做雙向復(fù)制，向兩側(cè)復(fù)制但移動(dòng)是不對(duì)稱(chēng)的稱(chēng)不對(duì)稱(chēng)雙向復(fù)制。
（3）復(fù)制方式
①眼型：復(fù)制區(qū)域形如一個(gè)眼睛，復(fù)制隨眼形結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張最終擴(kuò)張到整個(gè)復(fù)制子，有單向和雙向兩種。
②θ型：復(fù)制眼形成類(lèi)似θ結(jié)構(gòu)，發(fā)生在環(huán)狀DNA分子中。有雙向和單向復(fù)制，多數(shù)為雙向等速?gòu)?fù)制。
③D環(huán)型：線(xiàn)粒體DNA的復(fù)制呈現(xiàn)D環(huán)型。
線(xiàn)粒體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA。兩條鏈的復(fù)制是不對(duì)稱(chēng)的，先以新代分子中的負(fù)鏈為模板，合成一條新鏈，當(dāng)合成進(jìn)行到一定距離時(shí)，暴露本身一條鏈的復(fù)制點(diǎn)，從該點(diǎn)開(kāi)始，以正鏈為模板，合成一條新鏈，兩者的合成方向相反。由于起始點(diǎn)不在同一位置，所以合成的起始時(shí)間不同。復(fù)制是不對(duì)稱(chēng)進(jìn)行的。
④滾環(huán)型：
某些病毒、噬菌體DNA復(fù)制時(shí)形成滾環(huán)型。當(dāng)環(huán)型DNA分子復(fù)制時(shí)，先由一核酸內(nèi)切酶從正面的一個(gè)位置打開(kāi)一個(gè)缺口，使3’和5’端游離出來(lái)，3’端做為引物，在DNA聚合酶催化下，以負(fù)鏈為模板，連續(xù)合成一條新鏈，形成環(huán)狀雙鏈子代DNA，以原有的正鏈為模板連續(xù)或不連續(xù)合成一條負(fù)鏈最后形成一線(xiàn)形或環(huán)狀雙鏈分子。
3．復(fù)制的方向：從5’→3’。
4．復(fù)制的半不連續(xù)性
DNA復(fù)制在有條鏈上以5’→3’的方向連續(xù)合成，這條鏈成為前導(dǎo)鏈，在另一條鏈上，先按5’→3’方向合成許多與復(fù)制叉方向相反的崗崎片段（1968年，崗崎發(fā)現(xiàn)），隨著復(fù)制叉的移動(dòng)，許多不連續(xù)的崗崎片段在DNA連接酶的作用下，連接成一條完整的DNA鏈。這條鏈稱(chēng)隨從鏈。
5．模板和引物
模板為DNA。
引物是在DNA的復(fù)制過(guò)程中，每段崗崎片段復(fù)制時(shí)都要先合成一小段RNA作為引物，復(fù)制才能進(jìn)行，引物是引發(fā)DNA合成的。
6．引發(fā)和引發(fā)體
①DNA分子上一段短的區(qū)域發(fā)生熔解反應(yīng)，雙鏈分離成單鏈區(qū)域，由解旋酶使雙螺旋解開(kāi)，單鏈結(jié)合蛋白使雙鏈解開(kāi)，并覆蓋在單鏈上。
②解旋酶沿DNA移動(dòng)形成復(fù)制叉。
③在引物合成酶的作用下，形成一小段RNA引物，引發(fā)復(fù)制，引發(fā)過(guò)程中由若干蛋白和酶形成一個(gè)引發(fā)體。引發(fā)酶在隨從鏈上向復(fù)制叉方向前進(jìn)，在隨從鏈上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成隨從鏈的RNA引物。在前導(dǎo)鏈上引發(fā)只進(jìn)行一次。
7．鏈的延伸
鏈的延伸是在DNA聚合酶催化下，按模板的要求，在引物的3’-OH加上新的核苷酸。大腸桿菌DNA聚合酶有I、II、III三種。酶III是延伸的主要酶。
8．鏈的終止
在單向復(fù)制的環(huán)狀分子中，復(fù)制的終點(diǎn)就是復(fù)制原點(diǎn)。在雙向復(fù)制環(huán)狀分子中沒(méi)有固定的終點(diǎn)。
DNA鏈延長(zhǎng)結(jié)束后，DNA聚合酶I的作用下切除RNA引物，該酶具有5’→3’外切酶的功能。去除引物后留下的空缺由酶I催化填補(bǔ)，然后在又DNA連接酶將DNA片段連接起來(lái)。
9．復(fù)制忠實(shí)性的保證
為了保證復(fù)制的忠實(shí)性，生物體內(nèi)具有確保復(fù)制忠實(shí)性的機(jī)能。DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，可專(zhuān)門(mén)水解不配對(duì)的堿基，該酶在聚合開(kāi)始時(shí)具有選擇正確堿基的能力，同時(shí)有一種校對(duì)作用，刪去誤配的堿基，保證復(fù)制的高度忠實(shí)性.
（二）復(fù)制過(guò)程所需主要酶類(lèi)及相關(guān)蛋白
1．DNA聚合酶
DNA聚合酶的特點(diǎn)：
①以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物；
②反應(yīng)需接受模板指導(dǎo)；
③反應(yīng)需有引物3’-OH存在；
④雙鏈的伸展方向?yàn)?’→3’；
⑤產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。
（1）大腸桿菌DNA聚合酶
酶I：
①DNA聚合酶活性：通過(guò)核酸聚合反應(yīng)使DNA鏈沿3’→5’方向延長(zhǎng)。
②3’→5’外切酶活性：由3’端水解DNA鏈。
③5’→3’外切酶活性：由5’端水解DNA鏈。
3’→5’外切酶活性能切除單鏈DNA的3’末端。正常聚合反應(yīng)中3’→5’外切酶活性受抑制，當(dāng)出現(xiàn)錯(cuò)配堿基對(duì)，聚合反應(yīng)停止，由3’→5’外切酶切除錯(cuò)配堿基，聚合反應(yīng)才能繼續(xù)進(jìn)行。
5’→3’外切酶活性只用于雙鏈DNA，從5’端水解下核苷酸或寡核苷酸，如崗崎片段中5’引物的切除。
酶II：
催化由5’→3’方向合成DNA反應(yīng)，只有3’→5’外切酶活性，而無(wú)5’→3’外切酶活性。
其生理功能還不太清楚。
酶III：
與酶I一樣具有3’→5’， 5’→3’外切酶活性。酶III在復(fù)制過(guò)程中起主要作用。其酶由多亞基組成的點(diǎn)不對(duì)稱(chēng)兩臂的大分子。這樣可適于同時(shí)復(fù)制復(fù)制叉的前導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成。隨從鏈的模板在復(fù)制叉前進(jìn)處圍繞DNA聚合酶III的一個(gè)臂彎曲成環(huán)，使隨從鏈片段在5’→3’合成時(shí)也于復(fù)制叉前進(jìn)方向一致。當(dāng)隨從片段合成接近前導(dǎo)片段5’末端時(shí)，模板被釋放，模板上的環(huán)消除，合成的隨從鏈片段其5’→3’方向轉(zhuǎn)為與復(fù)制叉方向相反。合成下一片段時(shí)，模板再成環(huán)、環(huán)再消除等。
（2）真核生物DNA聚合酶。
真核生物DNA聚合酶活性與大腸桿菌DNA聚合酶活性相似。有α、β、γ、δ和ε5種。
酶α：同與酶III，由多亞基組成，是真核生物DNA復(fù)制的主要酶。常伴有引物合成酶。引物可以是DNA或RNA。
酶β：能一人工合成的DNA為模板，引物為寡聚脫氧核糖核苷酸?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中起作用。
酶γ：模板與引物與酶β相同，可能與線(xiàn)粒體DNA復(fù)制相關(guān)。
酶δ：天然DεNA需沒(méi)Dnase處理活性后才能作為模板和因物。具有3‘→5‘外切酶活性。
酶ε：其性質(zhì)與δ相似。
ε和δ的生物功能尚不清楚。
2．DNA連接酶
催化DNA切口處形成3’，5’-磷酸二酯鍵。目前應(yīng)用的有大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶。二者的區(qū)別：①輔助的因子不同（大-NAP；T4-ATP）。②底物不同，大腸桿菌DNA連接酶，只連接雙鏈DNA中的單鏈缺口，只能實(shí)現(xiàn)粘接，不能實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈間的平接。T4DNA連接酶，既能實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈間的粘接，有能實(shí)現(xiàn)平接。
3．單鏈結(jié)合蛋白（SSB）
SSB能刺激同源DNA聚合酶的活性。使天然DNA熔點(diǎn)降低，單鏈DNA與其結(jié)合后，能抵抗核酸酶的水解，可與解開(kāi)的兩條單鏈結(jié)合，穩(wěn)定單鏈以利于其發(fā)揮模板作用，促進(jìn)復(fù)制進(jìn)行。
4．DNA解旋酶
是一類(lèi)通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA的酶。復(fù)制時(shí)DNA解旋酶可以沿著隨從鏈模板的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)。Rep蛋白前導(dǎo)鏈模板的3’→5’方向移動(dòng). Rep蛋白和DNA解旋酶在DNA兩條鏈上協(xié)同作用,以解開(kāi)雙鏈DNA.DNA解旋酶還同時(shí)有引發(fā)酶的功能.
5．拓?fù)洚悩?gòu)酶
酶I：①雙鏈DNA超螺旋和送松弛態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。
②單鏈互補(bǔ)DNA的正鏈與負(fù)鏈形成雙環(huán)結(jié)構(gòu)。
③單鏈結(jié)狀DNA和無(wú)結(jié)狀DNA之間的轉(zhuǎn)換。
④雙鏈環(huán)狀DNA的環(huán)連或解環(huán)連作用。
酶II：使DNA的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋狀態(tài)。使DNA兩條鏈同時(shí)切開(kāi)，同時(shí)利用水解ATP的能量，使雙鏈結(jié)開(kāi)，讓一條DNA穿過(guò)斷口，再將切斷的末端重新關(guān)閉起來(lái)，形成負(fù)超螺旋。
6．引物酶
引物是一種特殊的RNA聚合酶，催化RNA引物的合成。引物酶作用需要有其他蛋白質(zhì)因子存在，即需要有引發(fā)前體的存在。
引發(fā)前體包含多種蛋白因子PriA、B、C ,dnaA、B、D、T。引物酶與引發(fā)前體兩者聯(lián)合，組成引發(fā)體。
7．端粒酶
是一種核糖核蛋白酶，是一種特殊的DNA聚合酶，屬于反轉(zhuǎn)錄酶。由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，以其中一段RNA序列為模板，延伸染色體的3’端解決DNA復(fù)制時(shí)引起的末端隱縮。
端粒酶RNA亞單位的結(jié)構(gòu)在不同真核生物之間差別很大，其蛋白質(zhì)組分至少有兩個(gè)以上多肽亞單位組成。
端粒酶能把端粒序列加到染色體末端，以補(bǔ)充染色體末端的自然丟失。在缺乏有效延伸機(jī)制時(shí)，端粒在歷經(jīng)每次細(xì)胞分裂之后即縮短。
（三）原核生物DNA復(fù)制模型和真核生物DNA復(fù)制特點(diǎn)
1．原核生物DNA復(fù)制模型
凱恩斯模型（θ型）：
大腸桿菌和噬菌體DNA以此模型復(fù)制。
復(fù)制機(jī)制：①?gòu)?fù)制從雙鏈特定的復(fù)制點(diǎn)開(kāi)始。
②分別以正負(fù)兩鏈為模板，以雙向方式進(jìn)行。
③正鏈膨大負(fù)鏈變形，逐漸形成θ型DNA分子。新生子鏈隨母鏈正負(fù)鏈內(nèi)外側(cè)延伸。
④延伸到一定程度閉環(huán)，形成兩個(gè)子代DNA分子
（2）滾換式模型
如φχ174噬菌體與單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制。復(fù)制時(shí)先以單鏈正鏈為模板合成一條互補(bǔ)鏈，形成環(huán)狀雙鏈復(fù)制型。
復(fù)制機(jī)制：①雙鏈DNA分子的正鏈被內(nèi)切酶切開(kāi)一個(gè)缺口，露出3’-OH和5’磷酸末端
②正鏈的一端固定在細(xì)胞膜上，以環(huán)狀閉和的負(fù)鏈為模板，以正鏈的3’-OH為引物，復(fù)制新的正鏈
③負(fù)鏈隨正鏈的延長(zhǎng)而滾動(dòng)，使模板上尚未復(fù)制的核苷酸轉(zhuǎn)到正鏈的延伸點(diǎn)，使正鏈的復(fù)制持續(xù)進(jìn)行。
④拉成現(xiàn)狀的正鏈的5’端部分逐漸延長(zhǎng)，并進(jìn)行直線(xiàn)伸展的復(fù)制
⑤新生的子鏈延長(zhǎng)到一定程度后，在連接酶作用下成環(huán)，線(xiàn)狀伸展部分也卷曲成環(huán)，形成兩個(gè)子代環(huán)狀DNA分子。
這種雙鏈DNA分子可在內(nèi)切酶作用下在正鏈切一切口，使正負(fù)鏈分開(kāi)，形成一個(gè)單鏈DNA分子。
2．真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)
（1）同原核生物一樣都是半保留復(fù)制。
（2）原核生物只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)DNA分子就是一個(gè)復(fù)制子。真核生物DNA上有許多復(fù)制起始點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，不固定在某一DNA序列處，每個(gè)起始點(diǎn)左右各有一個(gè)終止點(diǎn)，形成一個(gè)復(fù)制單位即復(fù)制子。不同生物，同一生物不同生長(zhǎng)條件下，其復(fù)制子大小不同，同一DNA上其復(fù)制子大小不均一。
（3）從復(fù)制起始點(diǎn)開(kāi)始向左右進(jìn)行，形成復(fù)制叉。許多復(fù)制叉碰在一起，最后完成整個(gè)DNA復(fù)制過(guò)程，形成兩個(gè)子代DNA分子。
（4）原核生物DNA復(fù)制可以雙向進(jìn)行，也可以單向進(jìn)行。真核生物DNA復(fù)制絕大多數(shù)雙向進(jìn)行，少數(shù)單向進(jìn)行。
（5）原核生物復(fù)制起始點(diǎn)可連續(xù)進(jìn)行新的復(fù)制。真核生物DNA在完成生命復(fù)制之前 ，每個(gè)起始點(diǎn)不能開(kāi)始新的復(fù)制。
（6）真核生物線(xiàn)粒體DNA的復(fù)制類(lèi)似于凱恩斯模型，是單向不對(duì)稱(chēng)的半保留復(fù)制，即D環(huán)型。
（四）DNA的損傷修復(fù)
1．DNA的損傷：
由于某些物理和化學(xué)因素的作用引起DNA序列發(fā)生變化，造成DNA損傷。
這些變化包括：堿基的丟失、堿基的插入、堿基的變化、DNA鏈的斷裂和交聯(lián)、堿基二聚體的形成等。
2．DNA損傷的修復(fù)
（1）光復(fù)活：可見(jiàn)光激活了光復(fù)活酶，它能分解由紫外線(xiàn)照射而形成的嘧啶二聚體
這種修復(fù)由于高度專(zhuān)一性，只作用于由紫外線(xiàn)照射形成的嘧啶二聚體。從低等生物到鳥(niǎo)類(lèi)都有，但高等動(dòng)物沒(méi)有。
（2）切除修復(fù)：在一系列酶的作用下，將DNA分子中損傷部分切除，并以完整的鏈為模板，合成出切除的部分，使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過(guò)程。
（3）重組修復(fù)：損傷的DNA片段上出現(xiàn)缺口，從完整的母鏈上將相應(yīng)的核苷酸序列片段移至缺口處，然后用再合成的序列來(lái)補(bǔ)上母鏈的缺失。
（4）SOS反應(yīng)：是細(xì)胞DNA受到損傷或復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下 ，為求得生存而出現(xiàn)的應(yīng)急效應(yīng)。
SOS反應(yīng)能誘導(dǎo)切除和重組修復(fù)中有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，加強(qiáng)切除和重組修復(fù)的能力。
SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的DNA聚合酶，能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，卻帶來(lái)很高的變異率，在某種情況下允許錯(cuò)配，以增加存活的機(jī)會(huì)。
是原核和真核生物在不利環(huán)境中求得生存的一種基本功能。
（五）RNA 指導(dǎo)的DNA的合成——逆向轉(zhuǎn)錄
1．逆轉(zhuǎn)錄酶：由αβ兩個(gè)亞基組成。催化活性與DNA聚合酶相似，具有三種活性：
（1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（逆轉(zhuǎn)錄）。
（2）DNA 指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（合成雙鏈 DNA）。
（3）3’→5’和5’→3’核酸外切酶活性。
由mRNA 3’-端polyA，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板，轉(zhuǎn)錄出cDNA構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)，篩選出特異的結(jié)構(gòu)基因。
2．逆轉(zhuǎn)錄病毒
致癌RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，稱(chēng)逆轉(zhuǎn)錄病毒。
病毒雙鏈DNA形成后即即時(shí)進(jìn)入細(xì)胞整合到宿主DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
3．逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義
（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒和嗜肝經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，整合到宿主細(xì)胞后可引起癌癥和肝炎，如果能尋找到逆轉(zhuǎn)錄酶的專(zhuān)一性抑制劑，可以防止致癌作用，為治療腫瘤提供重要線(xiàn)索，同時(shí)對(duì)這類(lèi)病毒進(jìn)行改造，可成為向細(xì)胞內(nèi)部引入外源遺傳信息的工具，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。
（2）AIDS病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。研究這類(lèi)病毒的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程可了解它的起因和尋找防治途徑。
（3）真核生物基因組中RNA逆轉(zhuǎn)錄基因的發(fā)現(xiàn)，表明真核生物正常細(xì)胞內(nèi)也存在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
三、基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工
DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為mRNA、tRNA、rRNA。
編碼mRNA分子的基因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)基因，終產(chǎn)物為蛋白質(zhì)。
編碼tRNA、rRNA分子的基因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)基因，終產(chǎn)物為tRNA、rRNA從不被翻譯成蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA分子序列相同的鏈為編碼鏈；與編碼鏈互補(bǔ)的DNA鏈在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中作為指導(dǎo)RNA合成的模板，稱(chēng)為模板鏈。
啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄合成為RNA的第一位堿基稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄開(kāi)始點(diǎn)。DNA上轉(zhuǎn)錄開(kāi)始部位的特殊區(qū)稱(chēng)為啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄終止的序列稱(chēng)終止子。
從啟動(dòng)子到終止子之間的全部DNA序列稱(chēng)轉(zhuǎn)錄單位。一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位可包括多個(gè)基因。
轉(zhuǎn)錄開(kāi)始點(diǎn)以前為上游，以后為下游。書(shū)寫(xiě)轉(zhuǎn)錄過(guò)程從左到右。
書(shū)寫(xiě)DNA僅寫(xiě)編碼鏈。轉(zhuǎn)錄開(kāi)始點(diǎn)為+1，開(kāi)始點(diǎn)前為-1，下游方向計(jì)數(shù)增加，上游方向計(jì)數(shù)絕對(duì)值增加。
（一）原核生物基因的轉(zhuǎn)錄
1．RNA聚合酶
E.coli RNA聚合酶催化E.coli三類(lèi)RNA的合成。RNA聚合酶的Vm比DNA聚合酶低的多。因此，DNA復(fù)制時(shí)速度快，鏈延伸僅在少數(shù)點(diǎn)進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄速度慢，可在很多點(diǎn)進(jìn)行，其結(jié)果是細(xì)胞中富集的RNA分子比DNA多。
RNA聚合酶與DNA聚合酶模板的精確性不同。RNA聚合酶對(duì)模板的精確性低，因?yàn)镽NA聚合酶缺乏外切核酸校對(duì)功能。
RNA聚合酶由2個(gè)α亞基，β、β’、δ和ω亞基組成，α亞基的功能是RNA合成的起始有關(guān)，β亞基的功能參與RNA合成的起始及延伸，β’亞基的功能是與DNA結(jié)合，δ亞基的功能是識(shí)別轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，增加核心酶與啟動(dòng)子結(jié)合的特異性，ω亞基的功能不清楚。除掉δ亞基的酶稱(chēng)核心酶。核心酶有催化活性，但沒(méi)有特異性。
2．轉(zhuǎn)錄過(guò)程
（1）、轉(zhuǎn)錄起始
RNA聚合酶全酶與模板DNA非特異性結(jié)合，并向啟動(dòng)子移動(dòng)，而后與啟動(dòng)子特異結(jié)合，形成緊密的啟動(dòng)子復(fù)合物，啟動(dòng)子處DNA雙鏈解開(kāi)，形成開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合物。
（2）、啟動(dòng)子識(shí)別
啟動(dòng)子位于DNA模板5’端大約10bp的富含A、T的起始序列中。起始序列中含有TTGACA和TATAAT兩個(gè)保守序列。分別位于-35bp和-10bp處，稱(chēng)-35區(qū)和-10區(qū)。-35區(qū)和-10區(qū)的數(shù)個(gè)核苷酸是啟動(dòng)子上開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合物的主要接觸點(diǎn)。
（3）、轉(zhuǎn)錄延伸
RNA聚合酶與啟動(dòng)子形成開(kāi)放啟動(dòng)子復(fù)合物后，RNA聚合酶催化第一個(gè)核苷酸與DNA模板結(jié)合，鏈延伸起始，δ亞基從核心酶解離，核心酶沿DNA模板移動(dòng)，同時(shí)解開(kāi)模板雙螺旋，暴露單鏈模板，當(dāng)RNA合成大約12bp時(shí)，DAN雙鏈再形成雙螺旋，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與模板分離。
當(dāng)RNA聚合酶到達(dá)DNA鏈終止信號(hào)處時(shí)，轉(zhuǎn)錄終止。
（4）、轉(zhuǎn)錄終止
細(xì)菌轉(zhuǎn)錄終止有兩種方式，一種需要終止因子ρ的終止，另一種不需要終止因子的終止。
ρ因子與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端特異位點(diǎn)結(jié)合，然后向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端移動(dòng)，在解旋酶的催化下解開(kāi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端與模板間的雙鏈，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物釋放。
不需要終止因子的終止方式的基因3’端具有兩個(gè)特點(diǎn)，一個(gè)是在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中有兩個(gè)富含GC的片段，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；另一個(gè)是其下游有4-8個(gè)A殘基。
當(dāng)RNA聚合酶遇到第一個(gè)富含GC的片段時(shí)，由于穩(wěn)定的GC堿基對(duì)使模板很難解旋，RNA聚合酶暫停移動(dòng)。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中富含GC部分相互配對(duì)，由于A-U鏈的連接，使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與模板間的連接作用減弱，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從模板上解離下來(lái)，完成轉(zhuǎn)錄終止。
3．轉(zhuǎn)錄后加工
（1）、mRNA轉(zhuǎn)化
原核生物初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在其自身合成過(guò)程仍在進(jìn)行時(shí)就開(kāi)始翻譯，翻譯后很快降解，因此mRNA不需要加工修飾。
（2）、rRNA和tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工
rRNA和tRNA都分別是合成大的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行剪接，形成成熟的RNA分子。編碼rRNA和tRNA的DNA總數(shù)不到基因組的1%。
rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括16S、23S和5SrRNA及1-4個(gè)tRNA序列，轉(zhuǎn)錄仍在進(jìn)行時(shí)核糖體蛋白顆粒就可安裝到RNA前體上，然后剪接成成熟的rRNA。
tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：轉(zhuǎn)錄出來(lái)的tRNA兩側(cè)有很長(zhǎng)的序列，先在核糖核酸酶的作用下從5’-端剪切，形成tRNA 5’-端結(jié)構(gòu)，然后核糖核酸酶D從3’-端剪切，形成tRNA 5’-端CCA結(jié)構(gòu)，最后再進(jìn)行甲基化、硫醇化等堿基修飾，產(chǎn)生稀有堿基。
（二）真核生物基因的轉(zhuǎn)錄
1．真核生物RNA聚合酶
（1）、酶I
位于核仁中，催化rRNA前體的合成，活性最強(qiáng)。
（2）、酶II
由8-12個(gè)亞基組成，其顯著特征是最大亞基有羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）。CTD結(jié)構(gòu)由多個(gè)7氨基酸殘基的重復(fù)序列組成，原核生物及真核生物的其他RNA聚合酶沒(méi)有此結(jié)構(gòu)。CTD結(jié)構(gòu)是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄活性所必須的，如部分或全部CTD的重復(fù)單位丟失，則細(xì)胞不能存活。CTD的磷酸化和去磷酸化作用，可影響RNA聚合酶II的功能。
酶II位于細(xì)胞核包括轉(zhuǎn)錄mRNA前體及一些小核RNA。
（3）、酶III
由9-15個(gè)亞基組成。酵母RNA聚合酶III的兩個(gè)大亞基與E.coli RNA聚合酶的β、β’亞基同源，兩個(gè)小亞基與原核生物RNA聚合酶的α-亞基同源，有6個(gè)特有的小亞基，其中一個(gè)具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，一個(gè)有酸性末尾，一個(gè)與酶的裝配有關(guān)，其余的與tRNA的合成有關(guān)，大亞基與轉(zhuǎn)錄的終止有關(guān)。
酶III位于細(xì)胞核，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA前體、及一些小RNA。
2．真核基因啟動(dòng)子
（1）、RNA聚合酶I啟動(dòng)子
酶I識(shí)別的啟動(dòng)子是編碼rRNA基因的啟動(dòng)子，核心啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄開(kāi)始點(diǎn)的周?chē)?，?45—+26bp處，促使轉(zhuǎn)錄起始。位于上游-180—-107bp處的控制元件可增加啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的效率。這兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)有獨(dú)特的堿基組成，富含GC堿基對(duì)。
酶I還需要兩個(gè)輔助因子UBF1和SL1。UBF1與核心啟動(dòng)子和UCE的有關(guān)序列特異結(jié)合，SL1不與啟動(dòng)子特異結(jié)合，但協(xié)助UBF1的結(jié)合，延長(zhǎng)覆蓋DNA的區(qū)域。一旦兩個(gè)因子結(jié)合，RNA聚合酶I就與核心啟動(dòng)子結(jié)合使轉(zhuǎn)錄起始。
（2）、RNA聚合酶II啟動(dòng)子
在所有組織中都表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游區(qū)有一個(gè)或多個(gè)拷貝的GC盒，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似原核生物的啟動(dòng)子。只在一種或少數(shù)幾種細(xì)胞中表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因，如珠蛋白基因等缺少GC盒，但含有與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的特征序列：a、TATA盒，類(lèi)似于原核生物啟動(dòng)子的Pribnow盒，決定轉(zhuǎn)錄的正確起始，但與原核啟動(dòng)子不同的是原核基因缺少Pribnow盒不能轉(zhuǎn)錄，而真核基因缺少TATA盒仍能轉(zhuǎn)錄，只是轉(zhuǎn)錄的效率下降，產(chǎn)物5’端不均一；b、CCAAT盒，位于TATA盒的上游，決定轉(zhuǎn)錄起始的效率；c、CACCC盒，位于CCAAT盒的上游，提供酶II結(jié)合位點(diǎn)及參與調(diào)控的結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
（3）、RNA聚合酶III啟動(dòng)子
酶III啟動(dòng)子不在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，而在基因編碼區(qū)內(nèi)。啟動(dòng)子分A、B兩個(gè)區(qū)域，A區(qū)在5’端，B區(qū)在3’端，稱(chēng)斷裂啟動(dòng)子。A、B區(qū)域內(nèi)堿基發(fā)生突變，將會(huì)降低轉(zhuǎn)錄效率。但兩者之間的距離不影響轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
3．結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與加工
（1）、轉(zhuǎn)錄的起始
真核生物結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是在RNA聚合酶II的催化下進(jìn)行的，起始過(guò)程中酶II與多種蛋白因子結(jié)合于啟動(dòng)子上形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。
A、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物
TATA盒結(jié)合蛋白（TBP）。TFII-B、F、E、H、D與酶II結(jié)合在啟動(dòng)子上形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。酶II沿模板滑動(dòng)時(shí)TFII-D留在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上。
B、基因轉(zhuǎn)錄的通用因子
（1）TFII-D：由TBP與8種組分組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，不僅決定RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，還參與CAAT盒等上游元件對(duì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄速率的調(diào)節(jié)。
（2）TFII-B：是緊接在TFII-D后加入轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的因子，具有參與俘獲RNA聚合酶II的作用。
（3）TFII-F：由兩個(gè)亞基組成，參與RNA鏈的延伸，并具有DNA解旋酶的活性。
（4）TFII-E：不直接與DNA結(jié)合，通過(guò)TFII-B與DNA結(jié)合，參與調(diào)節(jié)TFII-H的磷酸激酶活性。
（5）TFII-H：由多亞基組成，具有DNA解旋酶和蛋白激酶活性，參與RNA鏈的延伸和核苷酸剪切修復(fù)過(guò)程。在轉(zhuǎn)錄-修復(fù)的連接上發(fā)揮重要作用。
（6）TFII-A：對(duì)TFII-D與TATA盒的結(jié)合起穩(wěn)定作用。
（2）、轉(zhuǎn)錄的延伸
在鏈延伸因子的作用下，酶II轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物脫離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，RNA鏈開(kāi)始延長(zhǎng)。
（3）、轉(zhuǎn)錄后加工
轉(zhuǎn)錄出的前mRNA分子含內(nèi)含子及旁側(cè)區(qū)，就在核內(nèi)經(jīng)過(guò)加工之后轉(zhuǎn)運(yùn)到 核外進(jìn)行翻譯。
加工包括在3’-端加上Poly尾巴，約200個(gè)堿基，5’-端加上m7GpppNm帽子，及剪切掉其內(nèi)所含的內(nèi)含子，一些核酸snRNA參與剪接過(guò)程。
四、蛋白質(zhì)生物合成
1．遺傳密碼的性質(zhì)
密碼子由三個(gè)堿基組成，代表一個(gè)氨基酸，翻譯從起始密碼子開(kāi)始，從mRNA的5’端到3’端方向不重疊連續(xù)閱讀密碼子，一直到終止密碼子停止。
4種堿基組成64種密碼子，而體內(nèi)只有20種氨基酸，多密碼子代表一種氨基酸。UAA、UAG、UGA為終止密碼子。
（1）、簡(jiǎn)并
簡(jiǎn)并指多種密碼子編碼同一種氨基酸，代表一種氨基酸的密碼子稱(chēng)同義碼或同義詞。除色、蛋氨基酸只有一種密碼子外，其他氨基酸均有兩種以上密碼子。AUG、GUG既是起始密碼子又代表特定氨基酸。
（2）、密碼子不同位置的堿基特異性
密碼子的前兩個(gè)堿基特異性強(qiáng)，第三個(gè)堿基具有一定靈活性，第三位的G和U在任何密碼子中均沒(méi)有特殊意義，A在氨基酸的密碼子中也一樣。
密碼子的靈活性和簡(jiǎn)并性可使有些突變只是引起核苷酸序列的改變，而不引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，從而把突變對(duì)生物體的影響降低到最小。
（3）、通用與例外
在所有生物體內(nèi)密碼子幾乎是通用的，但在人和牛的線(xiàn)粒體內(nèi)存在例外：a、AUA是蛋氨酸而不是異亮氨酸；b、UGA不是終止密碼子而是色氨酸密碼子；c、AGA和AGG不是精氨酸密碼子而是終止密碼子；d、除AUG外，AUA、AUC、AUU也不做起始密碼子。
（4）、密碼子閱讀方向與mRNA編碼方向一致，從5’到3’。
（5）、密碼子不重疊，無(wú)逗點(diǎn)。
2．密碼子與反密碼子的相互作用
tRNA的反密碼子通過(guò)堿基反向配對(duì)識(shí)別mRNA的密碼子。兩者之間堿基配對(duì)不嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，而是搖擺配對(duì)，即前兩對(duì)嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)原則，第三對(duì)（密碼子的第三位與反密碼子的第一位）允許有一定的自由度，可出現(xiàn)GU、IU、IC、IA配對(duì)。
因此，tRNA識(shí)別的密碼子的數(shù)目由其反密碼子的第一為堿基的性質(zhì)來(lái)決定。
（二）核糖體
1．核糖體的組成
核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，有RNA和蛋白質(zhì)組成。
（1）、原核生物70S核糖體由50S的大亞基（16S rRNA和21種蛋白質(zhì)）和30S的小亞基（23S rRNA、5S rRNA和34種蛋白質(zhì)）組成。
（2）、真核生物80S核糖體由40S小亞基（16S rRNA和33種蛋白質(zhì)）和60S rRNA（28S、5.8S、5S rRNA和49種蛋白質(zhì)）組成。
2．核糖體的活性位點(diǎn)
核糖體可分為翻譯區(qū)和逐出區(qū)，有A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶活性位點(diǎn)、EF-TU位點(diǎn)、EF-G位點(diǎn)、5rRNA位點(diǎn)、mRNA位點(diǎn)、逐出位點(diǎn)等9個(gè)活性位點(diǎn)。
（1）、mRNA結(jié)合位點(diǎn)：位于30S亞基頭部，在S1蛋白等因子協(xié)同下與mRNA結(jié)合。
（2）、P位點(diǎn)：大部分位于30S亞基，與起始tRNA結(jié)合。
（3）、A位點(diǎn)：位于50S亞基，與氨基酸t(yī)RNA結(jié)合。
（4）、轉(zhuǎn)肽酶活性位點(diǎn)：位于A位與P位連接處，具有轉(zhuǎn)肽酶活性。
（5）、5SrRNA位點(diǎn)、EF-TU位點(diǎn)、轉(zhuǎn)位因子EF-G結(jié)合位點(diǎn)、GTP酶活性位點(diǎn)
3．多聚核糖體
在生物體細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)核糖體處于非活性穩(wěn)定狀態(tài)而單獨(dú)存在，少數(shù)核糖體與mRNA一起形成多聚核糖體。每一個(gè)核糖體上都單獨(dú)合成一完整的多肽鏈。
（三）原核生物蛋白質(zhì)生物合成的過(guò)程
1．氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)
活化的過(guò)程是氨基酸在酶的催化下，同ATP作用，產(chǎn)生氨基酰-AMP-酶復(fù)合物，即活性氨基酸。
氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)是活化氨基酸在氨基酰-tRNA合成酶催化下轉(zhuǎn)移給tRNA生成氨基酰-tRNA。
2．合成起始
合成起始是tRNA、30S亞基、50S亞基與mRNA結(jié)合形成70S起始復(fù)合物。
（1）、IF3促進(jìn)70S亞基解離，并與30S亞基結(jié)合，然后mRNA與30S亞基結(jié)合。
（2）、IF2結(jié)合于起始tRNA，然后再于30S亞基結(jié)合，使起始tRNA進(jìn)入30S亞基的P位。
（3）、50S亞基與30S亞基結(jié)合，GTP水解釋放能量，形成70S起始復(fù)合物，同時(shí)IF2、IF3釋放，A、P位處于正確的構(gòu)象。
3．肽鏈的延伸
當(dāng)70S起始復(fù)合物形成后，P位被起始tRNA占據(jù)，A位空著，然后相應(yīng)氨基酰-tRNA進(jìn)入A位，在延伸因子（EF-TU、EF-TS、EF-G）的作用下，轉(zhuǎn)肽酶把P位上的氨基?；螂幕D(zhuǎn)移到A位，形成肽鍵，然后GTP酶水解將A位的肽基-tRNA移到P位上，同時(shí)將P位上空載的tRNA逐出核糖體，mRNA向前移動(dòng)一個(gè)密碼子。
每增加一個(gè)氨基酸，即重復(fù)該過(guò)程一次，從而使肽鏈不斷延伸。
4．終止和肽鏈的釋放
當(dāng)mRNA模板上出現(xiàn)終止密碼子，不能被tRNA所識(shí)別，但可被釋放因子（RF1、RF2、RF3）所識(shí)別，肽鏈合成終止。在釋放因子的作用下將合成的肽鏈從核糖體釋放，并促使大小亞基解離及與mRNA模板脫離。
四、真核生物蛋白質(zhì)生物合成
1．合成起始
真核生物蛋白質(zhì)合成起始過(guò)程中需要蛋氨酰-tRNA、GTP、ATP和12種eIF參與。
（1）、起始氨基酰-tRNA與GTP和eIF2形成復(fù)合物，然后與40S亞基結(jié)合形成前復(fù)合物。
（2）、在起始因子的作用下消除mRNA 5’端非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，40S起始復(fù)合物與mRNA結(jié)合。
（3）、40S起始復(fù)合物由mRNA 5’帽子處沿非翻譯區(qū)移動(dòng)，直到第一個(gè)AUG處。起始氨基酰-tRNA識(shí)別起始密碼子。
（4）、40S起始復(fù)合物在AUG處正確定位后，起始因子從40S亞基上解離下來(lái)。60S亞基與40S亞基結(jié)合形成80S起始復(fù)合物。
2．肽鏈的延伸
真核生物普遍存在延伸因子eEF-1、eEF-2，真菌中還有eEF-3。
eEF-1有單體和多聚體兩種，單體的功能與原核生物的EF-Tu類(lèi)似，多聚體的功能與原核生物的EF-Ts類(lèi)似，eEF-2的功能與EF-G的相似。
肽鏈的延伸過(guò)程與原核生物類(lèi)似，在eEF的參與下通過(guò)進(jìn)位、肽鍵形成和移位三步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使肽鏈不斷延長(zhǎng)。
3．合成終止
真核生物有一種釋放因子——eRF，能識(shí)別三種終止密碼子。當(dāng)核糖體移到終止密碼子時(shí)，由于沒(méi)有氨基酰-tRNA能識(shí)別，eRF因子識(shí)別終止密碼子，并與之核糖體結(jié)合形成復(fù)合物，引起肽鏈釋放，核糖體與mRNA解離，肽鏈延伸終止。
原核生物與真核生物蛋白合成的區(qū)別：
（1）、起始因子不同
原核生物：IF-1無(wú)專(zhuān)一功能，可增加IF-2、IF-3的活性；IF-2使起始氨基酰-tRNA選擇性地與30S亞基結(jié)合，需要GTP；IF-3使30S亞基與mRNA起始部位連接，具有解離活性，使亞基保持解離狀態(tài)。
真核生物：eEF-1無(wú)專(zhuān)一活性，參與多個(gè)步驟；eEF-2被GTP活化，使起始氨基酰-tRNA與40S亞基結(jié)合；eEF-2A參與起始tRNA與核糖體的結(jié)合；eEF-3促進(jìn)核糖體解離成40S和60S亞基；eEF-4A與mRNA結(jié)合，具有解旋酶活性；eEF-4B刺激eEF-4F和eEF-4A的活性；eEF-4C促進(jìn)40S亞基與mRNA及60S亞基的結(jié)合；eEF-4D功能不詳；eEF-4F識(shí)別mRNA的帽子結(jié)構(gòu)；eEF-5釋放起始因子，結(jié)合60S亞基與核糖體；eEF-6保持60S亞基的解離狀態(tài)。
（2）、起始復(fù)合物形成過(guò)程不同
原核生物；起始復(fù)合物為70S，由50S和30S亞基組成。起始tRNA為甲酰氨基酰-tRNA，需三種起始因子參與。起始復(fù)合物的形成順序?yàn)椋?0S亞基與mRNA結(jié)合、起始tRNA與30S-mRNA復(fù)合物結(jié)合、40S亞基與30S亞基結(jié)合形成70S起始復(fù)合物、mRNA起始密碼子前有起始序列。
真核生物：起始復(fù)合物為80S，由40S和60S亞基組成。起始tRNA為蛋氨酰-tRNA，需12種起始因子參與。起始復(fù)合物的形成順序?yàn)椋?0S亞基與起始tRNA結(jié)合、40S-起始復(fù)合物與mRNA結(jié)合、60S亞基與40S亞基結(jié)合形成80S起始復(fù)合物。起始密碼子前無(wú)前導(dǎo)序列。
（3）、延伸因子不同
原核生物：有三種。EF-Tu促進(jìn)氨基酰-tRNA進(jìn)入A位；EF-Ts促進(jìn)GDP與GTP交換；EF-G促進(jìn)移位反應(yīng)。
真核生物：有兩種。eEF-1單體與EF-Tu功能相似。eEF-1聚體與EF-Ts功能相似，eEF-2促進(jìn)移位效應(yīng)。
（4）、釋放因子不同
原核生物：有三種。RF-2可識(shí)別UAA、UAG；RF-2可識(shí)別UAA、UGA；RF-3有刺激RF-1、RF-2的作用。
真核生物：只有一種。RF可識(shí)別三種終止密碼子。
（五）蛋白質(zhì)合成后的處理加工
1．肽鏈中氨基酸殘基的共價(jià)修飾
包括乙?；⒓谆?、磷酸化、轉(zhuǎn)氨基化、糖基化等。
2．除去N-端起始氨基酸
成熟的蛋白質(zhì)N-端大部分不是起始的蛋氨酸或甲酰蛋氨酸，必須在相應(yīng)酶的催化下除去。
3．信號(hào)肽的切除
在原核生物和真核生物中合成的蛋白質(zhì)N-端都有一長(zhǎng)為15-30氨基酸的信號(hào)肽，形成發(fā)夾狀α-螺旋結(jié)構(gòu)，在內(nèi)膜表面的信號(hào)肽酶作用下切除信號(hào)肽。
4．肽鏈的折疊
肽鏈合成沒(méi)有結(jié)束時(shí)折疊便已開(kāi)始，三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和肽鏈合成的終止同時(shí)完成。
5．切除前體中功能不必須肽段
合成的蛋白質(zhì)前體中有些是功能不需要的肽段，在專(zhuān)一性蛋白水解酶的作用下，切除多余的肽段。
6．二硫鍵的形成
兩個(gè)Cys的巰基氧化形成二硫鍵。
7．多肽鏈N端和C端的修飾
有些蛋白質(zhì)合成后多肽鏈N端可被乙?；揎?，C端被酰胺化修飾等。
六）、蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑
主要是一些抗生素如四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素、紅霉素、嘌呤霉素等。
五、基因表達(dá)的調(diào)控
在生活中并非所有的基因都一起表達(dá)，在特定的細(xì)胞或特定的時(shí)間內(nèi)，許多基因都被關(guān)閉，只有少數(shù)基因被表達(dá)，決定某個(gè)特定基因是否表達(dá)的過(guò)程即基因表達(dá)的調(diào)控。
（一）概述
1．順式作用元件和反式作用因子
基因活性的調(diào)控主要通過(guò)順式作用元件與反式作用因子相互作用而實(shí)現(xiàn)。
順式作用元件是對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個(gè)DNA分子上的基因，這種DNA序列通常不編碼蛋白質(zhì)，位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中。
反式作用因子：通常是蛋白質(zhì)，其編碼基因與其識(shí)別、結(jié)合的靶核苷酸序列不在同一個(gè)DNA分子上，其作用是合成場(chǎng)所擴(kuò)散到其發(fā)揮作用的其他場(chǎng)所。
2．結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因
結(jié)構(gòu)基因是編碼蛋白質(zhì)或RNA的任何基因，其編碼的蛋白質(zhì)有結(jié)構(gòu)蛋、酶和調(diào)節(jié)蛋白。
調(diào)節(jié)基因：參與其他基因表達(dá)調(diào)控的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。
調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)物通過(guò)與DNA上的特定位點(diǎn)結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)物與DNA特定位點(diǎn)的相互作用能以正調(diào)控的方式調(diào)節(jié)靶基因，也能以負(fù)調(diào)控方式調(diào)節(jié)靶基因。
3．啟動(dòng)子和終止子
位于轉(zhuǎn)錄單位開(kāi)始和結(jié)束位置上的序列為啟動(dòng)子和終止子。啟動(dòng)子位于基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的起始。終止子終止基因的轉(zhuǎn)錄。
啟動(dòng)子和終止子是受同一類(lèi)反式作用因子識(shí)別的順式作用元件。
4．操縱基因和阻抑蛋白
阻抑蛋白阻止基因的表達(dá)，與操縱基因結(jié)合。
操縱基因與啟動(dòng)子相鄰，是阻抑蛋白的靶位點(diǎn)。當(dāng)阻抑蛋白與操縱基因結(jié)合時(shí)會(huì)阻止RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，基因表達(dá)被關(guān)閉。
5．轉(zhuǎn)錄子
參與轉(zhuǎn)錄正調(diào)控的反式作用因子是轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中RNA聚合酶所需的輔助因子。
在真核生物無(wú)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)基因處于無(wú)活性狀態(tài)，RNA聚合酶不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子附近有作用位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子與其作用位點(diǎn)的結(jié)合啟動(dòng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。
（二）原核生物基因表達(dá)的調(diào)控
1．乳糖操縱子
（1）乳糖操縱子模型
乳糖操縱子由調(diào)節(jié)基因、操縱基因和3個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成。結(jié)構(gòu)基因z、y、a分別編碼β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶和堿性半乳糖苷轉(zhuǎn)乙?；浮?br>
誘導(dǎo)物存在時(shí)三種酶水平增加，乳糖可自身乳糖操縱子。
（2）、乳糖操縱子調(diào)控
調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是大分子阻抑蛋白，活性形式的阻抑蛋白可與DNA上的操縱基因結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄。
阻抑蛋白上有誘導(dǎo)物結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合誘導(dǎo)物。阻抑蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合后使阻抑蛋白失活，降低與DNA的親和力，使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。
乳糖及相似的誘導(dǎo)物可與阻抑蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，這種調(diào)節(jié)是負(fù)調(diào)控。
（3）、葡萄糖對(duì)乳糖操縱子的調(diào)控
在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中大腸桿菌首先利用葡萄糖作為能源，用完葡萄糖后激活乳糖操縱子，從而利用乳糖繼續(xù)生長(zhǎng)，這是一種轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程。當(dāng)葡萄糖水平低時(shí)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)cAMP來(lái)實(shí)現(xiàn)控制。
當(dāng)葡萄糖水平低時(shí)，cAMP水平升高，通過(guò)與CRP結(jié)合后增強(qiáng)了與DNA特定位點(diǎn)的親和力，cAMP-CRP復(fù)合物與DNA上的特定位點(diǎn)結(jié)合，激活乳糖操縱子，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。
2．SOS調(diào)節(jié)子
一系列受同一機(jī)制調(diào)節(jié)不相連接的基因稱(chēng)調(diào)節(jié)子。
SOS調(diào)節(jié)子中的控制成分是LexA和recA基因的產(chǎn)物。RecA蛋白在重組過(guò)程中刺激DNA鏈配對(duì)，參與重組修復(fù)。LexA是一阻抑蛋白，能與E.coli基因組中至少15種不同的操縱子結(jié)合，每個(gè)操縱子控制一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，從而幫助細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境的傷害。這些蛋白質(zhì)有的參與切割修復(fù)，有的參與控制細(xì)胞分裂。
在健康細(xì)胞中LexA和RecA表達(dá)的很少，有足夠的LexA蛋白關(guān)閉SOS基因的合成。損傷后單鏈DNA引發(fā)SOS系統(tǒng)激活，RecA與裂口處結(jié)合，激活蛋白水解。細(xì)胞內(nèi)LexA含量下降，解除了LexA對(duì)recA轉(zhuǎn)錄的阻礙。
3．色氨酸操縱子
色氨酸操縱子由啟動(dòng)子-操縱基因調(diào)節(jié)區(qū)和5個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成；調(diào)節(jié)區(qū)的前面有一個(gè)編碼阻抑蛋白的trpR基因，在結(jié)構(gòu)基因的前面有一個(gè)前導(dǎo)區(qū)，其內(nèi)含有弱化子序列。
色氨酸可與阻抑蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，是阻抑蛋白的活化形式，它與操縱子結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸濃度低時(shí)，色氨酸-阻抑蛋白復(fù)合物解離，釋放阻抑蛋白，阻抑蛋白離開(kāi)操縱基因，激活轉(zhuǎn)錄。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)濃度高時(shí)，弱化子序列內(nèi)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄終止子，轉(zhuǎn)錄在此處終止。
trpR系統(tǒng)和弱化子系統(tǒng)在不同細(xì)胞內(nèi)色氨酸水平上發(fā)揮的作用不同，色氨酸濃度低時(shí)，以阻抑蛋白-操縱子相互作用調(diào)控為主，而色氨酸濃度高時(shí)，以弱化作用調(diào)控為主。
4．原核生物基因表達(dá)與翻譯水平的調(diào)控
（1）反義RNA調(diào)控
反義RNA是以DNA編碼鏈為模板轉(zhuǎn)錄出的RNA，能與mRNA配對(duì)，從而抑制mRNA的翻譯。能控制一些原核和真核基因的表達(dá)。
（2）應(yīng)急應(yīng)答調(diào)控
細(xì)菌細(xì)胞環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)采用應(yīng)急應(yīng)答調(diào)控，如當(dāng)氨基酸缺乏時(shí)，從ATP和GDP合成一種新的化合物——5’-二磷酸-鳥(niǎo)苷-3’-二磷酸(ppGpp)、ppGpp可抑制操縱子轉(zhuǎn)錄的起始，使轉(zhuǎn)錄減慢。
（3）對(duì)mRNA半衰期的調(diào)節(jié)
原核生物mRNA的半衰期約為2-3min，許多因素可影響mRNA的半衰期，從而影響基因表達(dá)。降解速度決定mRNA半衰期的長(zhǎng)短，mRNA的降解由3’外切核酸酶來(lái)完成。
（4）mRNA分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的影響
mRNA本身的二級(jí)結(jié)構(gòu)可通過(guò)影響翻譯過(guò)程而調(diào)控基因的表達(dá)。
（5）蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控
細(xì)菌內(nèi)有些蛋白質(zhì)能控制自身mRNA的可翻譯性，這些蛋白質(zhì)在mRNA上有結(jié)合位點(diǎn)，可控制翻譯的起始或提前終止翻譯來(lái)調(diào)控。
（三）真核生物基因表達(dá)的調(diào)控
真核基因表達(dá)的調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控。
1．染色體水平上的基因活化調(diào)節(jié)
基因被轉(zhuǎn)錄激活后正常的染色體結(jié)構(gòu)被打亂。轉(zhuǎn)錄前染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是基因轉(zhuǎn)錄的前提。染色質(zhì)由緊密的壓縮狀態(tài)“開(kāi)啟”為可轉(zhuǎn)錄的疏松結(jié)構(gòu)，這種疏松結(jié)構(gòu)的形成與DNA的結(jié)構(gòu)、組蛋白的修飾及其他DNA結(jié)合蛋白的利用有關(guān)，其中主要是組蛋白的磷酸化和核心組蛋白的修飾。
2．基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)節(jié)元件
（1）啟動(dòng)子
RNA聚合酶II的啟動(dòng)子有含TATA盒的典型啟動(dòng)子和不含TATA盒的非典型啟動(dòng)子兩種。
A、TATA盒啟動(dòng)子：有TATA盒的典型啟動(dòng)子是上游啟動(dòng)子和增強(qiáng)子產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)所必需的。有時(shí)一個(gè)基因上串聯(lián)著兩個(gè)TATA盒，可分別對(duì)不同的誘導(dǎo)物作出應(yīng)答。在某些情況下，也參與組織特異性的選擇。
B、非典型的啟動(dòng)子：少數(shù)基因沒(méi)有典型的TATA盒啟動(dòng)子序列，有的無(wú)TATA盒啟動(dòng)子的序列富含GC盒，有的沒(méi)有GC盒。
①富含GC，無(wú)TATA盒的基因轉(zhuǎn)錄
這種基因轉(zhuǎn)錄起始是不規(guī)則的，只有基礎(chǔ)水平表達(dá)。持家基因是維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)、基本生命活動(dòng)所需的蛋白質(zhì)的編碼基因。5’上游沒(méi)有TATA盒，只有富含GC的序列，其中常有一個(gè)以上對(duì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的活化有主要作用。SP1結(jié)合位點(diǎn)有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。
②無(wú)TATA盒、GC盒的基因轉(zhuǎn)錄
TATA盒與轉(zhuǎn)錄起始子是決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的關(guān)鍵序列，在轉(zhuǎn)錄起始子上游加入TATA盒或GC盒可明顯提高轉(zhuǎn)錄起始子的轉(zhuǎn)錄效率。
（2）增強(qiáng)子
增強(qiáng)子是真核細(xì)胞中通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的一種遠(yuǎn)端遺傳性控制元件，可位于基因的5’-端、3’-端或基因內(nèi)的內(nèi)含子區(qū)，跨度為100-200bp。同啟動(dòng)子一樣由多個(gè)獨(dú)立的、具有特征性的核苷酸序列組成。
①增強(qiáng)子的特性：A、提高同一條DNA鏈上靶基因的轉(zhuǎn)錄效率；B、對(duì)同源或異源基因同樣有效；C、位置可在基因5’上游、基因內(nèi)或3’下游序列中；D、在DNA雙鏈中沒(méi)有5’與3’固定的方向性；E、可在遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)起作用；F、具有組織或細(xì)胞特異性；G、活性與其在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的空間方向性有關(guān)。
②增強(qiáng)子作用的機(jī)制
有三種方式：A、影響模板附近的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介形成增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間“成環(huán)”連接的模式活化轉(zhuǎn)錄；B、將模板固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置，有助于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進(jìn)RNA聚合酶在RNA鏈上的結(jié)合和滑動(dòng)；C、增強(qiáng)子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶進(jìn)入染色體結(jié)構(gòu)的“入口”。
③增強(qiáng)子的種類(lèi)：細(xì)胞特異性增強(qiáng)子、誘導(dǎo)性增強(qiáng)子。
（3）沉寂子：是一種負(fù)調(diào)控元件，參與基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。
（4）轉(zhuǎn)座元件：由于轉(zhuǎn)座元件的插入會(huì)帶來(lái)新的DNA結(jié)合蛋白的特異性序列及其結(jié)合位點(diǎn)，這些序列可以增強(qiáng)子的方式遠(yuǎn)距離調(diào)控。
（5）調(diào)控應(yīng)答元件
受同一機(jī)制控制的基因有轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的類(lèi)似的啟動(dòng)子元件，使基因應(yīng)答此類(lèi)因子的元件稱(chēng)應(yīng)答元件，如熱激應(yīng)答元件、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件、血清應(yīng)答元件等。
應(yīng)答元件含有保守序列，不同基因中的應(yīng)答元件拷貝數(shù)很接近，但不完全相同。應(yīng)答元件可位于啟動(dòng)子內(nèi)，也可位于增強(qiáng)子內(nèi)?；蚴茏R(shí)別啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中序列的特定蛋白質(zhì)調(diào)控，這種特定蛋白質(zhì)起轉(zhuǎn)錄因子的作用，是RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所必需的。
3．反式作用因子家族與其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域
同一類(lèi)序列特異性調(diào)節(jié)因子一般由多基因家族編碼特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，與具有保守性、序列相關(guān)的一組應(yīng)答元件相結(jié)合。這些既有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性，又能結(jié)合相應(yīng)特定序列的蛋白質(zhì)稱(chēng)反式作用因子家族。反式作用因子序列中的基序都與DNA結(jié)合，基序通常很短，僅為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一部分。
（1）類(lèi)固醇受體：是一組功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，每個(gè)受體都經(jīng)與特定的類(lèi)固醇結(jié)合而得到激活。
（2）鋅指結(jié)構(gòu)：鋅指結(jié)構(gòu)基序含一個(gè)DNA結(jié)構(gòu)域。
（3）螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋：一個(gè)螺旋位于DNA大溝內(nèi)，另一個(gè)位于所穿過(guò)程DNA的一角。
（4）螺旋-環(huán)-螺旋：螺旋具有兩親性，一側(cè)為疏水面，另一側(cè)為親水面。以二聚體形式與DNA結(jié)合，結(jié)合部位為堿性區(qū)。
（5）、 亮氨酸拉鏈：以二聚體形式與DNA結(jié)合。
可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控方式：
（1）、合成轉(zhuǎn)錄因子：這種轉(zhuǎn)錄因子是組織特異性因子，可在特定細(xì)胞內(nèi)合成。
（2）、修飾：一種因子的活性可通過(guò)修飾直接控制。
（3）、結(jié)合配基：一個(gè)因子的活性可通過(guò)結(jié)合配基而進(jìn)行激活或抑制。
（4）、切割釋放出轉(zhuǎn)錄因子：蛋白質(zhì)被切割形成轉(zhuǎn)錄因子的活性形式。
（5）、抑制劑釋放：轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)有時(shí)被抑制劑抑制。
（6）、與不同伴侶形成二聚體：轉(zhuǎn)錄因子有兩個(gè)伴侶分子，無(wú)活性的伴侶分子可使它失活。
4．鋅指結(jié)構(gòu)——一種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域
鋅指結(jié)構(gòu)中保守氨基酸的小基團(tuán)與鋅離子結(jié)合形成蛋白質(zhì)中相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
鋅指蛋白和類(lèi)固醇受體具有鋅指基序。
（1）、鋅指蛋白：其基序根據(jù)鋅結(jié)合位點(diǎn)凸出的氨基酸環(huán)命名，如Cys2/His2鋅指。鋅位于保守的Cys和His殘基形成的四面體結(jié)構(gòu)中，鋅指本身約含23個(gè)氨基酸，鋅指間通常有7-8個(gè)氨基酸。鋅指結(jié)構(gòu)通常串聯(lián)重復(fù)排列在一起，有多個(gè)鋅指存在，鋅指的數(shù)目不等。
鋅指與DNA結(jié)合時(shí)，每個(gè)鋅指的C-端形成α-螺旋與DNA結(jié)合，N-端形成β-折疊，α-螺旋伸展進(jìn)入DNA大溝，每個(gè)螺旋與DNA形成兩個(gè)基序特異性接觸，C-端的非保守性氨基酸負(fù)責(zé)識(shí)別特異的結(jié)合位點(diǎn)。
（2）、類(lèi)固醇受體
類(lèi)固醇受體鋅指結(jié)構(gòu)為Cys2/Cys2鋅指，此類(lèi)蛋白質(zhì)中鋅指是不重要的，DNA的結(jié)合位點(diǎn)較短，呈回文結(jié)構(gòu)。此鋅指結(jié)構(gòu)中每個(gè)Cys四面體中央都有一個(gè)鋅原子，兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)形成α-螺旋，再折疊成一個(gè)大球形結(jié)構(gòu)域。α-螺旋的芳香側(cè)鏈與連接兩個(gè)螺旋的β-折疊一起形成疏水中心。螺旋的N-端與DNA大溝接觸。
5．mRNA前體的選擇性剪接
真核細(xì)胞中一個(gè)基因的mRNA前體分子中某個(gè)內(nèi)含子5’的供點(diǎn)在特定條件下與另一個(gè)內(nèi)含子的3’受點(diǎn)進(jìn)行剪接，從而同時(shí)刪除兩個(gè)內(nèi)含子及其中間全部外顯子或內(nèi)含子，這種按不同方式對(duì)mRNA進(jìn)行的剪接稱(chēng)選擇性剪接。
來(lái)自一個(gè)基因的mRNA前體因選擇性剪接而產(chǎn)生多中mRNA，翻譯出不同的蛋白質(zhì)或組成一組相似的蛋白質(zhì)家族。
選擇性剪接的方式可因mRNA前體的外顯子或內(nèi)含子DNA序列中發(fā)生突變、缺失，影響5’、3’剪接點(diǎn)的數(shù)目和位置。
在錐蟲(chóng)、線(xiàn)蟲(chóng)及植物的葉綠體中還發(fā)生反式剪接，這種剪接發(fā)生在兩個(gè)RNA分子之間，以?xún)蓚€(gè)不同來(lái)源的RNA分子前體為底物，經(jīng)過(guò)剪接在成熟的mRNA非翻譯部分5’端拼接一小段剪接前導(dǎo)序列的RNA片段，這些片段并不存在于相應(yīng)的編碼基因前面，而由其他DNA鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)。
6．RNA編輯
是在RNA分子上出現(xiàn)的一種修飾現(xiàn)象，主要指mRNA在轉(zhuǎn)錄后因插入、缺失或核苷酸的替換改變了DNA模板來(lái)源的遺傳信息，從而翻譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質(zhì)。
RNA編輯的機(jī)制主要包括核苷酸的替換，如C-U替換、A-I替換、讀碼框架的改變、向?qū)NA等。
7．mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控
真核生物mRNA的穩(wěn)定性取決于分子內(nèi)本身的結(jié)構(gòu)特征、轉(zhuǎn)錄后修飾和所形成的RNP中蛋白質(zhì)的種類(lèi)。
真核生物mRNA比原核生物穩(wěn)定，其核細(xì)胞中持家基因的mRNA的壽命較長(zhǎng)，有些蛋白質(zhì)的mRNA壽命較短。
mRNA壽命的延長(zhǎng)增加了細(xì)胞內(nèi)某種mRNA的有效濃度，提高了蛋白質(zhì)合成的速度，這種翻譯水平的調(diào)控方式稱(chēng)翻譯擴(kuò)增。
8．翻譯的調(diào)控
翻譯因子的磷酸化調(diào)控、酵母mRNA翻譯的調(diào)控、轉(zhuǎn)鐵蛋白mRNA翻譯的調(diào)控。
第四講 基因工程的原理
基因工程是指在體外按既定的目的和方案，將一目的基因片段與載體結(jié)合，構(gòu)成DNA重組體，然后引入受體細(xì)胞，隨細(xì)胞繁殖而擴(kuò)增，同時(shí)也可進(jìn)行基因表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物或新性狀的遺傳物質(zhì)的技術(shù)。
基因工程又稱(chēng)遺傳工程、DNA重組技術(shù)、DNA克隆或分子克隆技術(shù)。
一、工具酶
基因工程中應(yīng)用的一些酶類(lèi)稱(chēng)工具酶，如限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶、DNA聚合酶I、堿性磷酸酶、S1核酸酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、末端轉(zhuǎn)移酶、T4多核苷酸激酶。
1、限制性?xún)?nèi)切核酸酶
是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，限于切割其序列之間的鍵的核酸內(nèi)切酶，主要發(fā)現(xiàn)于微生物中。
根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，所需輔助因子及裂解DNA方式的不同，將其分為三型，用I、II、III表示。
（1）、限制酶的特性
三型限制酶都能切割雙連DNA，有特定的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，催化反應(yīng)都需Mg++參與等共同特性。
I、III型酶兼具限制和修飾兩種特性，I型酶的識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致。I、III型已很少應(yīng)用。目前使用的主要是II型酶。
1）、識(shí)別特異性
a、識(shí)別序列具有縱軸對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)或稱(chēng)回文序列，如EcoR I的識(shí)別序列。
酶的識(shí)別序列長(zhǎng)度為4-6個(gè)核苷酸。四核苷酸識(shí)別序列的限制酶在DNA鏈上的切點(diǎn)多，產(chǎn)生片段數(shù)目多，長(zhǎng)度短，酶的特異性較低；六核苷酸識(shí)別序列的限制酶在DNA上的切點(diǎn)少，酶的特異性強(qiáng)。
2）、第二活性
在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，某些酶能切割與其特異性識(shí)別序列類(lèi)似的序列，這種現(xiàn)象叫限制酶的第二活性，也叫星號(hào)活性。具有星號(hào)活性的酶常在該酶名稱(chēng)前加以星號(hào)（*）表示。
3）、切割位點(diǎn)及酶切片段的末端結(jié)構(gòu)
限制酶切割的靶位點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)或附近。切割時(shí)水解3’-5’-磷酸二酯鍵的3’方向的磷酸二酯鍵，產(chǎn)物的5’為磷酸單酯基團(tuán)，3’為游離-OH。
切割后能形成良種末端，平頭末端和粘性末端。在對(duì)稱(chēng)軸上切斷產(chǎn)生平頭末端，在對(duì)稱(chēng)軸左右對(duì)稱(chēng)點(diǎn)交錯(cuò)切割產(chǎn)生粘性末端。粘性末端有5’粘性末端和3’粘性末端兩種。從5’端切產(chǎn)生5’粘性末端，從3’端切產(chǎn)生3’粘性末端。
有些酶有相同的識(shí)別序列，但有不同的切割位點(diǎn)；有些酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)都相同；有些酶有不同的識(shí)別序列，但切割后產(chǎn)生相同的粘性末端。
能產(chǎn)生相同粘性末端，而識(shí)別特異性不同的限制酶稱(chēng)同尾酶。
4）、識(shí)別序列的甲基化與限制酶活性
甲基化酶能使特異識(shí)別序列甲基化，保護(hù)該序列不被相應(yīng)限制酶切割。
（2）、限制酶切圖譜測(cè)定
限制酶切圖譜稱(chēng)DNA物理圖譜，是指某種DNA分子的限制酶切位點(diǎn)數(shù)目、片段長(zhǎng)度和排列順序的圖譜。
常用的測(cè)定方法是部分酶解法和雙酶水解法。
A、部分酶解法
選用某種限制酶將DNA分子完全水解，然后用電泳的方法測(cè)定完全酶解后片段的數(shù)目和整個(gè)片段的分子量。再用同一種酶對(duì)此DNA進(jìn)行酶切，測(cè)定酶解片段的分子量。將酶切片段的分子量與完全酶解片段的分子量進(jìn)行比較，排列出各片段的排列順序及酶切位點(diǎn)。如用Alu1完全水解1030bp的線(xiàn)性DNA分子，完全水解時(shí)切成750、150、80、50bp四個(gè)片段；部分酶切時(shí)得到800、2230、130bp三個(gè)片段，然后將這些片段重疊比較，推斷出完全酶解四個(gè)片段的順序?yàn)?50-80-50-750。
B、雙酶水解法
選用兩種限制酶分別對(duì)DNA分子進(jìn)行完全水解，電泳分離求出各片段的分子量，然后再用這兩種酶同時(shí)對(duì)此DNA分子進(jìn)行完全水解，電泳分離后求出其分子量，分析兩次結(jié)果的重疊情況，畫(huà)出酶切圖譜。
2、DNA連接酶
DNA連接酶催化相鄰的5’-磷酸基和3’-OH間形成磷酸二酯鍵，使雙鏈DNA單鏈缺口封合。
主要使用的有E.coli連接酶、T4噬菌體DNA連接酶，即T4連接酶。E.coli連接酶可實(shí)現(xiàn)粘接，T4連接酶可進(jìn)行粘接和平接。
3、堿性磷酸酶
催化DNA和RNA 5’-磷酸基水解，產(chǎn)生5’-OH末端。目前使用的有兩種：BAP和CIP，BAP耐熱，CIP特異性強(qiáng)。
4、DNA聚合酶I Klenow片段
Klenow片段是DNA聚合酶I羧基端大片段，具有DNA聚合酶和3’到5’外切酶活性，主要用于平端連接。
二、基因工程基本過(guò)程
包括目的基因的制備、基因載體的選擇、DNA重組、DNA重組體的轉(zhuǎn)化、重組體的篩選和鑒定、外源基因的表達(dá)等。
1、目的基因的制備
目的基因可以是含基因的DNA片段，也可以是不含多余成分的純基因。
（1）、直接從染色體中分離
先分離細(xì)胞基因組DNA，然后進(jìn)行特異性的限制酶解或非特異性的隨機(jī)切斷。隨機(jī)切斷包括機(jī)械的、化學(xué)的及非特異性的酶降解。
（2）、人工合成
小分子多肽或蛋白質(zhì)基因直接用化學(xué)合成即可制備，大分子蛋白質(zhì)基因先合成特定的序列片段，再通過(guò)DNA連接酶催化連接。
（3）、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
從mRNA到cDNA，對(duì)未知基因可先用此方法建立cDNA文庫(kù)，再篩選目的基因。
建立cDNA文庫(kù)的主要步驟包括：提取總RNA、分離mRNA并分級(jí)富集、逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，再用Klenow片段合成第二鏈，得到雙連DNA，連接于載體中并轉(zhuǎn)化。
在分子克隆中cDNA文庫(kù)比基因文庫(kù)更有用。
（4）、構(gòu)建基因文庫(kù)，釣取目的基因
基因文庫(kù)是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆體。
構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)一般先建大片段的基因文庫(kù)，再將已克隆的大片段剪切為小片段，然后再進(jìn)行亞克隆。
（5）、聚合酶鏈反應(yīng)制備特定基因
2、DNA重組
指外源DNA片段與載體DNA連接的過(guò)程。
DNA分子間連接的原則：
A、實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單易行；
B、連接點(diǎn)能被限制酶重新切割而便于回收插入片段；
C、有利于重組，避免載體自身環(huán)化；
D、對(duì)復(fù)制表達(dá)過(guò)程無(wú)干擾。
（1）、粘性末端連接
DNA分子的粘性末端有互補(bǔ)粘性末端和非互補(bǔ)粘性末端?；パa(bǔ)粘性末端可直接進(jìn)行連接，連接前用磷酸酯酶將載體的5’-端去磷酸化以減少載體的自身環(huán)化；非互補(bǔ)的粘性末端不能直接連接，經(jīng)修飾成平頭末端或部分平頭末端，再進(jìn)行連接。
（2）、平端連接
平端連接可用T4連接酶直接進(jìn)行連接，連接后可產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)而有利于重組子的篩選鑒定。但其連接效率較低，常對(duì)平頭末端進(jìn)行改造，進(jìn)行同聚物加尾，加上衍 或接頭再進(jìn)行連接。
（3）、定向克隆
使外源DNA按既定方向插入載體DNA分子中的過(guò)程叫定向克隆。
一般是利用外源DNA分子和載體DNA末端兩種形式。一種是兩端為非同源的互補(bǔ)粘性末端，另一種是一側(cè)為互補(bǔ)粘性末端，一側(cè)為平齊末端。
定向克隆能有效防止載體自身環(huán)化，提高連接效率。
（4）、人工接頭連接
A、連接子：人工合成兩條完全互補(bǔ)的寡聚脫氧核糖核苷酸，長(zhǎng)8-12bp，內(nèi)有一限制酶位點(diǎn)，與外源DNA片段連接后用限制酶產(chǎn)生粘性末端，再與同一限制酶分割后的載體連接。適用于平頭末端的改造和連接。
B、適配子：是一條人工合成的寡聚脫氧核糖核苷酸，與另一適配子互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈后具有突出的某種粘性末端，與外源DNA連接后產(chǎn)生粘性末端，再與載體連接。
（5）、多聚核苷酸連接
又叫同聚物加尾。在外源DNA和載體DNA分子中，分別加上多聚脫氧腺苷或多聚脫氧胸苷，根據(jù)dA/dT、dC/dG互補(bǔ)在連接酶作用下連接起來(lái)。
3、將DNA重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞
將質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程叫轉(zhuǎn)化；以噬菌體、病毒為載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程叫轉(zhuǎn)染；以噬菌體為媒介將外源導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)。
不同的宿主，轉(zhuǎn)移DNA的方法不同：E.coli：用CaCl2處理或電激法導(dǎo)入；酵母：原生質(zhì)體或乙酸鋰法轉(zhuǎn)化；動(dòng)物細(xì)胞：磷酸鈣、DEAE、葡聚糖、原生質(zhì)體、電穿孔法、顯微注射法等。
（1）、用CaCl2處理進(jìn)行轉(zhuǎn)化
受體細(xì)胞應(yīng)具有的條件：a、接受外源DNA的能力；b、限制酶缺陷型；c、重組缺陷型；d、使外源DNA復(fù)制；e、表達(dá)重組子提供的表型；f、非培養(yǎng)條件下難以生存。
轉(zhuǎn)化的過(guò)程包括：用CaCl2處理E.coli，將重組體導(dǎo)入E.coli兩步。
（2）、λDNA的體外包裝
體外包裝是指離體條件下將提取的包裝蛋白與帶COS位點(diǎn)的DNA混合產(chǎn)生噬菌體的過(guò)程。
λ噬菌體的包裝是指λ噬菌體未成熟為感染顆粒時(shí)，其頭部蛋白先組裝成一個(gè)中空的頭部前體，然后λDNA塞入其中，形成λ噬菌體基因組文庫(kù)。
λ噬菌體的體外包裝技術(shù)常用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)和真核基因文庫(kù)。
4、DNA重組體的篩選和鑒定
從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選出含重組體的細(xì)胞，并鑒定重組體的正確性是分子克隆的最后一道工序。
（1）、根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選（又叫遺傳檢測(cè)法）
A、利用載體提供的表型篩選
分子克隆載體攜帶的遺傳標(biāo)志包括抗藥性標(biāo)志、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)志、報(bào)道基因標(biāo)志等。
①利用基因插入失活是常用的篩選方法，當(dāng)抗生素性基因前有一類(lèi)調(diào)控序列時(shí)，可用插入該序列外源片段進(jìn)行插入表達(dá)篩選。
②利用β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。
③利用病毒載體的標(biāo)志基因進(jìn)行篩選。
④用報(bào)道基因與哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子融合，測(cè)定基因表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率。
B、利用插入序列提供表型特征進(jìn)行篩選
外源基因能對(duì)宿主細(xì)胞所具有的突變發(fā)生體內(nèi)互補(bǔ)體反應(yīng)，使轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)外源序列中基因編碼的表型特征。
（2）、檢測(cè)目的基因或相應(yīng)的基因產(chǎn)物
A、核酸雜交
是根據(jù)同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，其中一條鏈為探針，用于檢測(cè)未知核酸片段。
①核酸雜交可分為DNA：RNA雜交；DNA：DNA雜交。
②檢測(cè)DNA用Southern雜交，檢測(cè)RNA用Northern雜交。
③雜交方法有膜上印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、菌落原位雜交等。
④雜交常用的支持物有：硝酸纖維薄膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜、濾紙等。
⑤雜交探針有基因組探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針等。
⑥探針的標(biāo)記分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記同位素有32P、3H、35S等；非放射性標(biāo)記有生物素、地高辛、光敏生物素、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。
⑦標(biāo)記方法有切口平移法、隨機(jī)引物法、化學(xué)交聯(lián)法等。
⑧把待檢核酸轉(zhuǎn)移到支持物上的方法有毛細(xì)管法（印跡法）、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等。
B、利用免疫學(xué)方法篩選
免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附、固相放射免疫、免疫熒光抗體、Western雜交等。
Western雜交是將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜后，先用目的基因產(chǎn)物的抗體與之反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體檢測(cè)。
C、翻譯法篩選
影響特定mRNA在體外翻譯體系中的翻譯來(lái)篩選的方法分為阻斷翻譯雜交法和釋放翻譯雜交法。
a、阻斷翻譯雜交法
用轉(zhuǎn)化菌落提取重組DNA，經(jīng)變性后與未分級(jí)分離的mRNA雜交，回收核酸進(jìn)行體外翻譯，通過(guò)電泳與未經(jīng)雜交mRNA體外翻譯產(chǎn)物比較，這樣目的基因編碼的蛋白質(zhì)由于翻譯被抑制而篩選。
b、雜交釋放翻譯法
先將克隆DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜上，再與未分級(jí)的mRNA或總RNA雜交，洗脫結(jié)合RNA進(jìn)行體外翻譯，用電泳和放射后自顯影分析鑒定翻譯產(chǎn)物。
D、物理篩選法
重組DNA與載體DNA電泳比較、R-環(huán)檢測(cè)、限制酶切圖譜法等。
三、基因載體的選擇
載體是攜帶外源DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具，其本質(zhì)是DNA。常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和病毒等。
1、質(zhì)粒
質(zhì)粒是染色體外能自主復(fù)制的雙鏈閉環(huán)DNA分子。常用的質(zhì)粒是來(lái)自E.coli 經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒，如pBR322、pUC系列、pSP系列、pGEM系列等。
質(zhì)粒一般克隆較小的外源DNA片段，用于基因工程的質(zhì)粒應(yīng)具備的條件：
①能高效地獨(dú)立自主復(fù)制：質(zhì)粒復(fù)制與宿主細(xì)胞的繁殖無(wú)關(guān)，在細(xì)菌染色體 DNA停止復(fù)制時(shí)，質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制。
②有可供選擇的標(biāo)志，最好是雙重標(biāo)志：常用的標(biāo)志有氨芐青霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因和E.coli的lac Z基因等。
③同一種限制酶只有一個(gè)切點(diǎn)，在復(fù)制子以外的適當(dāng)部位，便于外源基因的插入。酶切位點(diǎn)最好位于篩選標(biāo)志基因內(nèi)部。
④分子量盡可能小，拷貝數(shù)多，一般在5kb左右，質(zhì)粒較小，較穩(wěn)定。
2、λ噬菌體
λ噬菌體是感染細(xì)菌的病毒?；蚪M是雙鏈線(xiàn)性DNA，兩端各有一個(gè)單鏈互補(bǔ)粘性末端，稱(chēng)cos位點(diǎn)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后粘性末端互補(bǔ)結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。
野生型λ噬菌體的基因組復(fù)雜，限制酶切位點(diǎn)多，不宜做基因載體。目前使用的是對(duì)其進(jìn)行改造后構(gòu)建的載體；一類(lèi)是插入型載體，只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，如λgt系列；另一類(lèi)是替換型載體，有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，如EMBL3和EMBL4。
λgt系列常用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)，EMBL系列常用于構(gòu)建DNA文庫(kù)。
3、粘粒
是一種特殊的質(zhì)粒。在E.coli中以雙鏈環(huán)形存在，含有ampr抗藥性標(biāo)志和復(fù)制起始點(diǎn)，有一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)，具有cos位點(diǎn)。
4、M13噬菌體
是一種絲狀單鏈?zhǔn)删w，在E.coli中以雙鏈復(fù)制型存在。
M13噬菌體的特性：（1）、可包裝大片段外源DNA；（2）、感染細(xì)菌后，復(fù)制環(huán)狀單鏈DNA，經(jīng)包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細(xì)胞外不產(chǎn)生溶菌。
改造后的M13mp系列特點(diǎn)：（1）、在M13基因4、2之間的間隔區(qū)可供外源DNA插入；（2）、有l(wèi)ac調(diào)控元件及l(fā)ac Z作為選擇標(biāo)志；（3）、在lac Z氨基末端部位上連一個(gè)多位點(diǎn)接頭，供克隆用。
5、動(dòng)物病毒載體
上述4中載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒、M13噬菌體，只適合在原核生物中表達(dá)，不能在真核生物細(xì)胞中表達(dá)。用于真核生物基因表達(dá)的載體有猴病毒40（SV40），人類(lèi)朊病毒，牛乳頭狀瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、疫苗病毒、昆蟲(chóng)桿狀病毒等。
6、酵母質(zhì)粒載體
目前應(yīng)用的是酵母人工染色體構(gòu)建的載體YAC系統(tǒng)，該載體可直接克隆大片段DNA，基因組包括端粒、復(fù)制起始點(diǎn)、篩選標(biāo)志、核心序列及限制酶切位點(diǎn)。
7、載體功能分類(lèi)
可分為克隆載體、穿梭載體和表達(dá)載體。
（1）、克隆載體
以繁殖外源DNA片段為目的，一般具有自我復(fù)制、克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)志、分子量小、拷貝數(shù)多等特點(diǎn)。
（2）、穿梭載體
又稱(chēng)雙宿主載體，可在兩種不同宿主中復(fù)制。用于原核和真核細(xì)胞間的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移。由原核序列和真核序列兩部分組成，原核序列便于在E.coli中復(fù)制擴(kuò)增；真核序列用于轉(zhuǎn)染目的基因的真核細(xì)胞的篩選，并保證基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。
（3）、表達(dá)載體
用來(lái)將克隆的外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)的。根據(jù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不同又分為融合型載體和非融合型載體。
四、基因表達(dá)
1、真核基因在E.coli中的表達(dá)
基因表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。目前廣泛應(yīng)用的是原核表達(dá)系統(tǒng)。
基因在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)應(yīng)注意的問(wèn)題：
（1）、要構(gòu)建一個(gè)合適的或高效表達(dá)載體
原核表達(dá)載體的要求：
①有一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；
②有SD序列及SD序列與起始密碼子之間要有合適的距離；
③在克隆基因與啟動(dòng)子之間有正確的閱讀框架；
④外源基因下游加入不依賴(lài)ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
（2）、編碼基因要完整，沒(méi)有插入序列；
（3）、將真核基因克隆到原核基因中，以保證產(chǎn)物表達(dá)的穩(wěn)定性；
（4）、克隆基因中保留信號(hào)肽序列，使表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)菌分泌到溶液中，有利于產(chǎn)物的分離純化。
2、真核基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)
由于在原核細(xì)胞中真核基因不能進(jìn)行內(nèi)含子的自我剪接，表達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)行翻譯后加工，不能進(jìn)行正確折疊，使表達(dá)產(chǎn)物量少，活性低，因此目前傾向于用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大部分基因。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)真核基因應(yīng)注意的問(wèn)題：
（1）、根據(jù)研究目的選擇合適的載體-宿主表達(dá)系統(tǒng)。
哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時(shí)與穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)兩類(lèi)。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)用于根據(jù)產(chǎn)物活性來(lái)證實(shí)分離基因，從cDNA文庫(kù)中篩選基因，誘變對(duì)蛋白質(zhì)生物活性與功能的影響的分析等研究；穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)用于大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
（2）、選擇合適的細(xì)胞系
不同的培養(yǎng)細(xì)胞系攝取和表達(dá)外源基因的能力相差非常大。同一基因在一種細(xì)胞系上有效，但在另一種細(xì)胞系中可能完全不表達(dá)。
（3）、外源基因
基因一般來(lái)自cDNA克隆或基因組。構(gòu)建cDNA庫(kù)時(shí)常引入輔助序列，基因表達(dá)是要去掉這些額外序列；基因組DNA不一定含有表達(dá)所需的調(diào)控序列，需要轉(zhuǎn)換啟動(dòng)子或增強(qiáng)子；真核基因轉(zhuǎn)錄的起始密碼子必須是轉(zhuǎn)錄物中的第一個(gè)起始密碼子。
基因一般來(lái)自克隆或基因。
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發(fā)表于 2006-2-25 22:46:38
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發(fā)表于 2006-2-26 11:24:02
版主先生， 能否給大家一個(gè)舒心的面孔，所有人都得看著你這張難受的臉。實(shí)話(huà)實(shí)說(shuō)了，
形象也是要加分的呦。