纖維素酶酶解小麥麩皮技術(shù)初步研究

apple12151007

　　纖維素酶酶解小麥麩皮技術(shù)初步研究

　　王在貴 劉朝良* 王云生

　　(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

　　摘要：本試驗(yàn)采用還原糖法研究了不同酶解時(shí)間、溫度、pH及酶濃度條件對(duì)纖維素酶酶解小麥麩皮效果的影響。結(jié)果表明纖維素酶酶解小麥麩皮的最適條件為：酶解時(shí)間為15min，溫度為37℃，pH值為6，最適酶濃度為0.04IU/m。
　　關(guān)鍵詞：纖維素酶;小麥麩皮;酶解
　　Preliminary Study on Cellulase Enzymolysis Technology on Wheat bran
　　Wang zaigui Liu zhaoliang Wangyunsheng
　　(Life Sciences College，Anhui Agricultural Unmversity)
　　Abstract : The technology of wheat bran degradation with cellulose by DNS method was researched and the main reaction condition that included differential reaction time, temperature, pH and enzyme concentration influencing the effection of cellulase degrading wheat bran was researched.The results showed that the appropriate condition for cellulose activity degrading cellulose in wheat bran was that the reaction time was 15 min, the reaction temperature was 37 ℃, and pH 6.0, the enzyme concentration was 0.04 IU/mL.
　　Key word: Cellulase;Wheat bran;Cellulose degeneration
　　纖維素是世界上最豐富的可再生資源, 我國(guó)每年僅作物秸稈的纖維產(chǎn)量就達(dá)2億噸以上，開(kāi)發(fā)和利用纖維素是促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。除反芻動(dòng)物瘤胃微生物可發(fā)酵利用纖維素外，其他家畜禽消化道缺乏纖維素酶，對(duì)纖維素不能有效利用或利用率低。小麥麩皮常被用作動(dòng)物飼料，因含有較高的纖維素類物質(zhì)而限制了其在配方中的用量。利用纖維素酶酶解小麥麩皮中纖維素是解決這一問(wèn)題的有效途徑之一。所以，對(duì)纖維素酶的研究開(kāi)發(fā)是提高含纖維素類飼料資源利用效率的重要途徑。隨著菌種選育和發(fā)酵技術(shù)的快速發(fā)展，飼用纖維素酶將在畜牧業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生不可低估的作用。
　　1.材料與方法
　　1.1材料 纖維素酶(由某生物公司提供，于-30℃冰箱中保存);小麥麩皮(于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24小時(shí)備用)。
　　1.2主要儀器和設(shè)備 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;臺(tái)式電子天平;精密pH計(jì);7220型分光光度計(jì);恒溫水浴鍋。
　　1.3試劑 3,5-二硝基水楊酸(DNS);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。
　　1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與酶解反應(yīng)體系
　　1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取濃度為0.01mg/ml葡萄糖0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml于試管中(做3個(gè)平行)，以蒸餾水補(bǔ)加到1.5ml。再加入DNS試劑3ml，沸水浴10min，取出后用自來(lái)水冷卻，加入10ml蒸餾水稀釋混勻，測(cè)定吸光度OD550值，以葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)， OD550為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　1.4.2酶解反應(yīng)體系 稱取0.5g麩皮于試管中，加入纖維素酶液5ml，按照設(shè)定條件做酶解反應(yīng)后，吸取酶解液1.5ml于試管中，同上方法測(cè)定OD550值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可換算出還原糖含量。空白樣不進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)樣設(shè)兩個(gè)平行樣。
　　1.5酶活力測(cè)定(吉爾鮑特，1983)
　　1.5.1酶活力單位定義。在一定的溫度和pH條件下，1min從底物溶液中分解產(chǎn)生1μmol還原糖(表示為還原糖當(dāng)量)所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(IU)進(jìn)行換算。
　　1.5.2底物。底物為1.5%CMC-Na。
　　1.5.3酶液制備。準(zhǔn)確稱取取1.000g該酶制劑，用去離子水稀釋200倍待測(cè)定酶活力用。
　　1.5.2酶活力測(cè)定體系。反應(yīng)體系添加1.4ml底物，預(yù)熱10min后加0.1ml酶液，反應(yīng)10min后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定還原糖生成量，即可換算出酶活力值。以上均為靜止恒溫水浴體系，分別設(shè)置1下空白樣和2個(gè)平行樣?？瞻坠芟燃?.4ml底物，10分鐘后加3mlDNS試劑，再加酶樣0.1ml，沸水浴顯色10min，其余同前。
　　2. 結(jié)果
　　2.1溫度對(duì)酶解效果的影響 上述反應(yīng)體系中，設(shè)定初始條件為pH6.0、反應(yīng)時(shí)間15分鐘，分別于30、35、40、50℃分別測(cè)定還原糖釋放量。結(jié)果(圖1)顯示，纖維素酶酶解小麥麩皮的最適溫度為37℃，從30℃到37℃還原糖釋放量上升較快，37℃后趨于下降。
　　
　　2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 上述反應(yīng)體系(pH6.0、溫度為37℃)分別設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為10、15、20、30、40min。測(cè)定還原糖釋放量，結(jié)果(圖2)顯示，纖維素酶酶解小麥麩皮隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)還原糖釋放量逐漸增加，15分鐘后增加緩慢。
　　
　　由圖2可看出，纖維素酶水解小麥麩皮的最佳時(shí)長(zhǎng)約為17min，因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，實(shí)際生產(chǎn)成本也會(huì)越大，所以選定反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)17min作為最佳。
　　2.3 pH值對(duì)酶解效果的影響 上述反應(yīng)體系(其他條件為最適條件)分別設(shè)定pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0測(cè)定還原糖釋放量，結(jié)果(圖3)顯示，纖維素酶水解小麥麩皮的最適pH為 6.0，由于此pH值接近生活用水的pH值，所以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較為方便。
　　
　　2.4 酶濃度對(duì)酶解效果的影響 將反應(yīng)體系中的纖維素酶濃度設(shè)定為0.01、0.02、0.04、0.08IU/ml，測(cè)定還原糖釋放量，結(jié)果(圖4)顯示，隨著酶濃度的增加，還原糖釋放量也逐漸增加，但從0.04-0.08IU/ml范圍增加幅度放緩。最佳酶濃度在0.04IU/ml左右。
　　 4.討論與結(jié)論
　　小麥麩皮中纖維素類物質(zhì)主要為纖維素、木聚糖和木質(zhì)素等，其中纖維素可被最終降解成葡萄糖供動(dòng)物吸收利用。而木聚糖和木質(zhì)素的最終降解產(chǎn)物能否被動(dòng)物吸收利用目前尚無(wú)明確報(bào)道。纖維素被酶解成低聚糖對(duì)動(dòng)物腸道具有保護(hù)作用，而且酶作為蛋白質(zhì)本身安全無(wú)毒，在飼料中適量添加是不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生有害影響的。這些都為纖維素酶在飼料中的應(yīng)用提供理論和實(shí)際依據(jù)。
　　全價(jià)顆粒飼料的生產(chǎn)常伴有調(diào)質(zhì)和擠壓制粒過(guò)程，雖然飼料中含有的纖維素對(duì)酶具有保護(hù)作用，但高溫造粒仍然會(huì)造成一定程度的酶活力損失，影響該酶的實(shí)際使用效果。而體外酶解小麥麩皮可將條件控制得較溫和，減少酶活力損失，有利于該酶發(fā)揮最大潛力，且酶在隨飼料進(jìn)入動(dòng)物消化道后仍然發(fā)揮作用，可見(jiàn)體外酶解小麥麩皮方法可產(chǎn)生較為廣泛的作用。通過(guò)王在貴等(2006)對(duì)該酶的研究可以看出，該酶在動(dòng)物消化道可以發(fā)揮最大酶活力。
　　本實(shí)驗(yàn)中使用的纖維素酶最適溫度比常溫稍高，特別是夏季酶解條件比較易于達(dá)到和控制。最適酶解時(shí)間較短，有利于縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。最適作用pH在5.0~6.0，這和我國(guó)南方某些地方的自來(lái)水pH值比較接近，酶解條件比較容易控制。從實(shí)驗(yàn)2.2結(jié)果可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物還原糖生成的量逐漸增加，對(duì)反應(yīng)速度產(chǎn)生了限制作用，但如果在動(dòng)物消化道內(nèi)，新產(chǎn)生的葡萄糖和二糖可被迅速吸收，酶解反應(yīng)得以繼續(xù)維持，可見(jiàn)在體外可以適當(dāng)控制酶解時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。從實(shí)驗(yàn)2.4結(jié)果可以看出，酶和其作用底物的相對(duì)濃度都可對(duì)反應(yīng)速度產(chǎn)生較大的影響，可見(jiàn)在實(shí)際生產(chǎn)中合理控制酶的添加濃度有利于節(jié)約成本，提高生產(chǎn)效率。
　　目標(biāo)酶的選擇也十分關(guān)鍵，一般情況下，應(yīng)選擇在體外能夠高效酶解小麥麩皮且穩(wěn)定性好、到體內(nèi)仍可發(fā)揮作用的酶，所以生產(chǎn)前往往需要研究酶的特性，評(píng)價(jià)酶的使用效果，以便做合理取舍，這樣才能夠達(dá)到較好的酶解效果。
　　參考文獻(xiàn)
　　[1]吉爾鮑特(美).酶法分析手冊(cè)[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1983,第1版
　　[2]武漢大學(xué)主編.分析化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2000,第3版
　　[3]王在貴，張莉，張宏福等.纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J] .中國(guó)飼料，2006(1)：12~14.
　　[4]鄒國(guó)林，朱汝潘編著.酶學(xué)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社,第1版

ququ51

謝謝樓主分享

saturnbio

謝謝分享！

鄭旭陽(yáng)

體外生物學(xué)效率實(shí)驗(yàn),一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何模擬動(dòng)物的消化道環(huán)境,
1. 大家將焦點(diǎn)聚集在溫度,PH, 時(shí)間, 胃蛋白酶和小腸液處理,
2. 但是嚴(yán)重忽視了試管內(nèi)的酶制劑,底物濃度要和酶制劑在全價(jià)飼料中的劑量基本相符,
3.也許,相符后,有些酶制劑根本得不到降解產(chǎn)物, 原封未動(dòng),

lilyyang

體外生物學(xué)效率實(shí)驗(yàn),一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何模擬動(dòng)物的消化道環(huán)境.
是呀，體內(nèi)與休外實(shí)驗(yàn)相差很大的。