【轉(zhuǎn)帖】豬細(xì)小病毒的介紹

嗷嗷乖乖

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一類(lèi)小DNA病毒，是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，其危害主要表現(xiàn)為受感染的母豬，特別是初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。該病毒對(duì)理化因素有很強(qiáng)的抵抗力，廣泛分布于世界各地并在大多數(shù)豬場(chǎng)呈地方性流行，嚴(yán)重地影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病的嚴(yán)重危害受到了國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者的關(guān)注，對(duì)PPV診斷方法及免疫防制的研究成為了熱點(diǎn)之一。

豬細(xì)小病毒感染可依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)作出初步診斷，一般認(rèn)為，如果僅妊娠豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒發(fā)育異常，同時(shí)有證據(jù)表明是傳染性疾病時(shí)，則應(yīng)考慮到PPV感染的可能，但進(jìn)一步確診必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。自1967年，Cartwright等首次報(bào)道PPV病以來(lái)，有關(guān)該病診斷方法的研究報(bào)告較多，從最初的病毒分離鑒定，到血凝及血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等免疫學(xué)方法，直到核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到PPV病的診斷中。

病毒分離和鑒定用于診斷PPV感染的最大優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以作為最后確診。用于分離PPV的病料，一般為流產(chǎn)或死產(chǎn)胎兒的腦、腎、肝、肺、睪丸、胎盤(pán)及腸系膜淋巴結(jié)等，其中以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟的分離率最高。。雖然此方法是最準(zhǔn)確的診斷方法，但是其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且需要一定的技術(shù)條件和設(shè)備，另外，其感染力會(huì)隨著胎兒死亡時(shí)間而降低從而限制了臨床應(yīng)用；紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)操作簡(jiǎn)便易行，且能進(jìn)行快速、大量的診斷，但是其靈敏度低、特異性不強(qiáng)，只能作為輔助診斷方法。

血凝抑制(HI)試驗(yàn)是檢測(cè)PPV抗體最常用的經(jīng)典方法，一般采用試管法和微量法。利用HI試驗(yàn)檢測(cè)人工感染PPV的豬，發(fā)現(xiàn)感染后5d即可檢測(cè)到相應(yīng)抗體，12~14d 抗體滴度高達(dá)1024~4096，并能持續(xù)多年檢出抗體。待檢血清進(jìn)行HI試驗(yàn)時(shí)需要首先進(jìn)行熱滅活處理，然后再用紅細(xì)胞吸附，以除去血清中的非特異性血凝素，進(jìn)一步用高嶺土吸附以除去或減少血清中非特異性抑制因子。目前，該方法在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用。血清中和試驗(yàn)(SN)也是檢測(cè)PPV抗體的方法之一，其原理是利用被檢血清的抗體中和PPV，然后根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的病變情況來(lái)計(jì)算血清抗體的滴度。SN的特異性比HI高，但是SN的操作較為復(fù)雜，首先要進(jìn)行病毒感染力的測(cè)定，而PPV在低劑量時(shí)并不引起細(xì)胞病變，從而限制了該方法的使用。1988年，Hohdatsu等率先建立了PPV的ELISA診斷方法并用于檢測(cè)PPV的血清抗體，我國(guó)姜永厚等(1997)建立了雙抗體夾心ELISA用于檢測(cè)PPV的抗原，可建立的ELISA診斷方法非特異性較強(qiáng)。邵振華、田海燕(中國(guó)獸藥監(jiān)察所)用濾紙采集豬血樣，加入到預(yù)先用PPV抗原處理的微孔板小孔內(nèi)，進(jìn)行免疫間接過(guò)氧化物酶染色試驗(yàn)檢測(cè)PPV抗體，在2-3h內(nèi)即可觀(guān)察結(jié)果。對(duì)比試驗(yàn)證實(shí)比HI敏感(高7.4%)，特異性更強(qiáng)。就操作過(guò)程而言，該方法比HI要簡(jiǎn)單，且具有采血方式新穎、送樣方便以及抗原軟板可隨意剪取、不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但該方法中抗原的保存時(shí)間有限，因此限制了該方法的普及應(yīng)用。王川慶(1996)等利用對(duì)流免疫電泳技術(shù)檢測(cè)PPV抗原和抗體，在pH8.6、離子濃度為0.1mol/L、電流4mA的條件下，1~2h便可得出結(jié)果，而且抗原和血清不需做特殊處理，使用的是普通電泳儀和常規(guī)試劑，因此有一定的推廣價(jià)值，但是與HA或HI相比，其敏感度偏低。何啟蓋等(1999)將在IBRS-2細(xì)胞上同步培養(yǎng)增殖的PPV經(jīng)甲醛滅活后，用經(jīng)硫酸銨沉淀、透析濃縮后的病毒液致敏乳膠建立了檢測(cè)PPV抗體的乳膠凝集試驗(yàn)診斷方法。致敏的乳膠抗原與PPV陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒，而且與生理鹽水、PBS、犢牛血清、豬瘟、衣原體、口蹄疫、偽狂犬病、弓形蟲(chóng)病及萎縮性鼻炎等陽(yáng)性血清不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。用LAT和HI同時(shí)對(duì)203份血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的陽(yáng)性符合率為93.16%。乳膠凝集試驗(yàn)與HI相比，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于臨床上的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，被許多學(xué)者譽(yù)為“傻瓜技術(shù)”，因此具有良好的推廣應(yīng)用前景。該方法的不足之處在于它所檢測(cè)的抗體主要是IgM，因此只能用于疾病的定性診斷，不能進(jìn)行血清抗體滴度的監(jiān)測(cè)。Rivera等(1986)利用固相免疫熒光技術(shù)(IBA)檢測(cè)PPV的抗原和抗體獲得成功，其具有特異、敏感、快速、檢出率高的特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離鑒定常用的方法。

單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，效價(jià)高并可在體外大量制備等特點(diǎn)，已成功地用于許多疾病的診斷和治療。Mengeling等1984年就研制出PPV的McAb并用于臨床診斷。國(guó)內(nèi)俞太尉和丘惠深(1993)用PPV7909株免疫Balb/c小鼠，融合其脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，篩選出4株分泌抗PPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系(F1、E6、G9、D4)，用D4株分泌的單克隆抗體建立的ELISA和HI同時(shí)對(duì)70份血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性符合率為97.5%。但二者相比，因該ELISA具有從加樣到結(jié)果判定均可自動(dòng)化，不需對(duì)被檢血清進(jìn)行處理，樣本容量大等特點(diǎn)而更適合于PPV病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。而核酸探針技術(shù)是一種分子水平的檢測(cè)技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，特別適用于疾病的早期診斷和類(lèi)癥鑒別診斷，是近二十年來(lái)應(yīng)用較多的一項(xiàng)診斷技術(shù)。Krell等(1988)率先將核酸探針技術(shù)應(yīng)用于PPV的診斷，他們將以PPV RF DNA酶切得來(lái)的3.0kb的DNA片段用放射性同位素標(biāo)記后作為探針通過(guò)打點(diǎn)雜交檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中的PPV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最低可檢測(cè)0.1pg DNA。與HA的比較結(jié)果表明，該方法比HA敏感100倍以上。國(guó)內(nèi)吳保成等(1992)對(duì)PPV RF DNA的Hind III和Pst I片段，進(jìn)行生物素標(biāo)記后用作探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該探針能檢測(cè)到約100pg的PPV DNA。侯喜林等(1997)同樣利用PPV DNA的Hind III和Pst I片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記后用作探針檢測(cè)PPV DNA，結(jié)果能與其自行分離的7株P(guān)PV毒株的DNA雜交，最低檢出限量為40pg DNA。之后，他們又將該探針用于臨床檢測(cè)PPV感染獲得成功(侯喜林等，1998)。地高辛標(biāo)記探針與放射性標(biāo)記探針相比具有相同的敏感性，并且克服了生物素標(biāo)記探針敏感性差、背景深的特點(diǎn)，因此是探針標(biāo)記中較為理想的方法。核酸探針技術(shù)用于PPV抗原的檢測(cè)比HA試驗(yàn)敏感、特異性強(qiáng)，適宜于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PPV感染的診斷，但該方法的技術(shù)含量高，只能在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，不適合大面積臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

1985年，美國(guó)PE-Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室Mullis等人發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），使人們夢(mèng)寐以求的體外大量擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。之后，該技術(shù)應(yīng)用到了疾病診斷方法中。Moliter等(1991)根據(jù)PPV基因組序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增VP2基因中158bp的片段，利用酶切和探針雜交證實(shí)了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，同時(shí)對(duì)四株P(guān)PV及CPV、PRV的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PCR反應(yīng)的特異性，該方法至少可以檢出100fg的PPV DNA，相當(dāng)于1 PFU的PPV量。國(guó)內(nèi)，趙俊龍等利用擴(kuò)增PPV VP2基因中的445bp片段，使PCR診斷結(jié)果更易于判讀，同時(shí)建立了PPV和PRV二聯(lián)診斷方法。

綜上所述，用于PPV感染的診斷方法很多，各種方法具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，相對(duì)而言，目前應(yīng)用較多的是HA和HI試驗(yàn)，這兩種方法基本能滿(mǎn)足常規(guī)的病原檢測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查等需要。要得到病原學(xué)的確診，則最好利用病毒分離鑒定方法，這時(shí)免疫熒光技術(shù)經(jīng)常成為首選。其它血清學(xué)診斷方法則根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)室條件和情況選擇應(yīng)用。毋庸諱言，核酸探針和PCR診斷技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越廣，這兩項(xiàng)技術(shù)尤其是PCR技術(shù)則是所有診斷技術(shù)中靈敏度最高的診斷方法。

PPV感染目前還沒(méi)有有效的治療方法，同其它許多病毒病的防制一樣，該病也主要以免疫預(yù)防為主，由于PPV血清型單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控制PPV感染的一種行之有效的方法,就其疫苗研究進(jìn)展綜述如下：

1 弱毒疫苗 最早發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用于臨床的是PPV NADL-2弱毒株，該毒株是將PPV強(qiáng)毒在實(shí)驗(yàn)室利用細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代50次以上致弱的,分子生物學(xué)研究證實(shí)，該毒株的基因組比強(qiáng)毒株P(guān)PV NADL-8在VP2基因上少300bp。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血清學(xué)陰性的懷孕母豬口服或鼻內(nèi)接種NADL-2株，盡管有病毒血癥存在，卻不引起胎兒感染；若將該毒株經(jīng)子宮內(nèi)接種，可引起胎兒感染，從而導(dǎo)致繁殖障礙。日本學(xué)者Fujisakl等將PPV野毒在豬腎細(xì)胞上低溫(30°C)連續(xù)傳54代，產(chǎn)生了HT變異株，該毒株接種豬后不產(chǎn)生病毒血癥，但能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體和較強(qiáng)的免疫力。在此基礎(chǔ)上，Akihiro等將HＴ株在豬腎細(xì)胞上培養(yǎng)并用紫外線(xiàn)照射后傳代，獲得了安全性更好的HT-SK-C株，利用該毒株生產(chǎn)的弱毒疫苗已在日本商品化。我國(guó)學(xué)者對(duì)PPV弱毒苗也進(jìn)行了研究，蔣玉雯等從廣西初產(chǎn)母豬所產(chǎn)死胎臟器中，分離出一株P(guān)PV自然弱毒株。用該毒株接種PPV HI抗體陰性的4月齡豬和懷孕14-23天的后備母豬，結(jié)果不產(chǎn)生病毒血癥，母豬分娩正常，所產(chǎn)小豬吃奶前HI抗體陰性。另外，免疫的懷孕母豬用強(qiáng)毒株攻擊后49天剖殺，胎兒發(fā)育正常，胎心采血HI抗體陰性，取胎兒臟器進(jìn)行組織培養(yǎng)也未分離出病毒，而對(duì)照豬攻毒后產(chǎn)生了病毒血癥并導(dǎo)致繁殖障礙，從胎兒臟器中分離出PPV。盡管已有多株弱毒疫苗在臨床上應(yīng)用，但是由于PPV強(qiáng)毒株的大量存在，人們對(duì)病毒重組及弱毒返強(qiáng)的擔(dān)心一直使弱毒苗的應(yīng)用受到一定限制。

2 滅活疫苗

（1）單價(jià)滅活疫苗 自1976年國(guó)外就有關(guān)于PPV滅活疫苗的研究報(bào)道，并于80年代在美國(guó)、澳大利亞、法國(guó)等國(guó)家普遍應(yīng)用。在我國(guó)，潘雪珠等研制成功PPV滅活疫苗之后，韓孝成等、肖馳等、鄔捷等、呂建強(qiáng)等也先后研制出PPV滅活疫苗。PPV滅活疫苗的研制中，應(yīng)用的滅活劑有福爾馬林、β-丙內(nèi)酯（β-PL）、AEI（N-乙酰乙烯亞胺）以及BEI（二乙烯亞胺）等。Fujisaki用福爾馬林滅活病毒制成的疫苗，免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高的抗體滴度，但保護(hù)效果不理想；潘雪珠比較了福爾馬林和AEI的滅活效果，證實(shí)AEI優(yōu)于福爾馬林；Joo等用β-丙內(nèi)酯滅活的疫苗，可使豬產(chǎn)生的抗體至少持續(xù)4個(gè)月以上。免疫佐劑是影響PPV滅活疫苗效果的重要因素，Moliter等比較了13種不同佐劑用于PPV滅活疫苗的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%氫氧化鋁膠，順丁烯乙酰(EMA)、CP-20961(Avridin)，油水乳劑及dimethyl–

dioctadecyl –ammonium bromide (DDA)作佐劑的疫苗，均誘導(dǎo)豬產(chǎn)生了高滴度的抗體，而用油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑混合物、SDS和氫氧化鋁混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低。目前在PPV滅活苗的制備中，經(jīng)常采用的佐劑是氫氧化鋁和油水乳劑。

（2）滅活二聯(lián)疫苗 PRV，PPV和JEV病均是引起母豬繁殖障礙的主要疾病，研制出滅活多聯(lián)疫苗可以簡(jiǎn)化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。Mengeling等將通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)增殖的PPV和PRV，用AEI在37℃滅活后混合，加入10%的Al(OH)3制成滅活二聯(lián)疫苗用于免疫預(yù)防試驗(yàn)。16頭后備母豬進(jìn)行兩次免疫，間隔期為2周，8頭母豬在妊娠后9周用PRV攻擊，8頭母豬在妊娠后6周用PPV攻擊，然后分別在第13周和12周宰殺，觀(guān)察保護(hù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16頭母豬均未發(fā)生繁殖障礙，從胎兒體內(nèi)未檢出PRV和PPV。對(duì)免疫母豬的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，經(jīng)二次免疫后，母豬的PRV中和抗體和PPV HI抗體滴度，與采用單苗免疫的抗體水平相當(dāng)或稍高，從而說(shuō)明PRV—PPV滅活二聯(lián)疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。井出誠(chéng)彌等曾用PPV和JEV二種病毒的弱毒疫苗混合后免疫母豬，產(chǎn)生的PPV和JEV抗體水平分別與相應(yīng)單苗的相同。國(guó)內(nèi)鄔捷等用PPV滅活苗與JEV滅活苗混合或同時(shí)免疫后備母豬均取得了滿(mǎn)意的效果。姜天童等利用幼齡胎豬生產(chǎn)PPV、利用小鼠增殖JEV后，分別滅活制成滅活二聯(lián)疫苗，通過(guò)二聯(lián)苗和單聯(lián)苗比較試驗(yàn)顯示，二聯(lián)苗與兩種單苗免疫豬產(chǎn)生的PPV和JEV抗體水平無(wú)顯著差異。以上試驗(yàn)均證實(shí)兩種病毒抗原同時(shí)刺激機(jī)體沒(méi)有相互干擾作用。

3 PPV疫苗的免疫程序 在早期的研究報(bào)告中，PPV疫苗的免疫均為間隔2-3周二次注射，隨著疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)一次免疫注射也能達(dá)到良好的效果，免疫后的后備母豬在妊娠40d時(shí)用強(qiáng)毒攻擊，可以獲得完全保護(hù)。此外，Edwards等認(rèn)為PPV疫苗只能用于沒(méi)有母源抗體的豬，因?yàn)樵谔镩g條件下母源抗體可能在不同程度上干擾疫苗的效果。Paul等發(fā)現(xiàn)豬群在接種PPV滅活疫苗時(shí)，母源抗體水平低的豬與血清學(xué)陰性豬的免疫應(yīng)答完全一樣，而中等水平的母源抗體對(duì)疫苗免疫有輕微干擾作用，高效價(jià)抗體對(duì)疫苗有明顯干擾作用。呂建強(qiáng)等進(jìn)行了PPV母源抗體對(duì)滅活疫苗免疫效果影響的研究，結(jié)果證實(shí)不論母源抗體水平高低均不會(huì)明顯抑制疫苗的主動(dòng)免疫反應(yīng)，但是具有低效價(jià)母源抗體豬的主動(dòng)免疫抗體反應(yīng)規(guī)律，與具有高效價(jià)母源抗體豬的主動(dòng)免疫抗體反應(yīng)規(guī)律不同。在母源抗體滴度大于1:149.5時(shí)，滅活疫苗接種后抗體水平先降低然后上升，升幅只有1-3倍；而母源抗體小于1:25.6時(shí)，主動(dòng)免疫抗體持續(xù)上升，母源抗體陰性的豬抗體增幅最大。根據(jù)PPV的流行病學(xué)特點(diǎn)，仔豬吃奶后2-3天即可在血液中檢測(cè)到母源抗體，并于8-14天達(dá)到高峰，母源抗體可持續(xù)20-24周，因此PPV疫苗的免疫接種時(shí)間應(yīng)選擇在20周左右。建議，于配種前一個(gè)月、半個(gè)月各免疫一次。

4 新型疫苗展望 盡管PPV的弱毒苗和滅活苗在豬細(xì)小病毒病的預(yù)防控制中起到了十分重要的作用，但是各種疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)的潛在威脅，以及滅活疫苗免疫效果不穩(wěn)定等。因此，尋找和發(fā)展更為安全有效的疫苗一直是豬細(xì)小病毒病免疫預(yù)防研究的主題。

（1）基因工程亞單位疫苗 Martinez等將PPV VP2基因克隆到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，并成功地在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)，表達(dá)的VP2多肽能自我裝配成類(lèi)病毒粒子(Virus-Like Particles，VLPs)，用其免疫母豬能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。盡管未見(jiàn)有關(guān)該種疫苗進(jìn)一步研究和應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)，但是VP2基因在體外表達(dá)的蛋白能自我包裝成類(lèi)病毒粒子的特性，為重組多價(jià)亞單位疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。

（2）基因工程多價(jià)亞單位疫苗 Sedlik等將PPV VP2和包含淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原決定簇區(qū)相連，然后克隆于桿狀病毒表達(dá)載體PACYM，轉(zhuǎn)染表達(dá)PPV：VP2-LCMV蛋白，利用該重組蛋白免疫鼠可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CTL反應(yīng)，在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，并可抵抗致死量的LCMV攻擊。之后，Sedlik又將LCMV的CD8+ T細(xì)胞抗原決定簇多肽共價(jià)結(jié)合于1mm的脂質(zhì)微球上，與上述表達(dá)的PPV：VP2-LCMV蛋白一起進(jìn)行了免疫小鼠的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者都能誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)。但是PPV：VP2-LCMV攜帶的抗原量比脂質(zhì)體微球少100倍時(shí)，誘導(dǎo)的CTL活性仍比脂質(zhì)體微球誘導(dǎo)的CTL活性高6倍，并且只有PPV：VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻擊。Richard等用PPV VP2共價(jià)結(jié)合乙肝病毒HBSAg的抗原決定簇區(qū)多肽，然后免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了很強(qiáng)的針對(duì)插入的HBSAg決定簇的T細(xì)胞反應(yīng)，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻擊。這些結(jié)果均說(shuō)明PPV VP2類(lèi)病毒粒子，作為一種抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有很大的潛在價(jià)值，并為進(jìn)行多價(jià)重組疫苗的研究創(chuàng)造了良好的條件。

PRV和PPV在臨床上經(jīng)?；旌细腥镜默F(xiàn)象已有報(bào)導(dǎo)，因此研制出這二種病毒的重組疫苗對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐也具有重要意義。PRV屬于皰疹病毒科a皰疹病毒亞科的豬皰疹病毒I型，該病毒基因組是雙鏈線(xiàn)狀的DNA，大小約為150Kbp，含有多個(gè)可缺失的非必需基因，插入外源基因容量可達(dá)20Kbp，易于進(jìn)行基因操作，因此具有作為病毒載體的必要條件。迄今為止，國(guó)內(nèi)外用PRV作基因表達(dá)載體已成功表達(dá)了10多種外源目的基因。如Zijl等最早實(shí)現(xiàn)了病原保護(hù)性抗原基因在偽狂犬病毒中的表達(dá)，他們將豬瘟病毒（HCV）的囊膜蛋白基因E1插入到gG啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了幾株表達(dá)E1的重組偽狂犬病毒；將這些重組病毒進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果接種重組病毒的豬均能產(chǎn)生對(duì)HCV、PRV的高滴度中和抗體，并可保護(hù)豬免受PRV、HCV的強(qiáng)毒攻擊。國(guó)內(nèi),王家富等構(gòu)建了攜帶豬瘟病毒E2基因的重組偽狂犬病毒。但是上述研究所用載體均為PRV弱毒株，人們對(duì)其安全性仍有擔(dān)心。為些，我們實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)成功地研制出PRV的TK-/gG-/LacZ+ 疫苗株，該毒株缺失了PRV的毒力基因（TK），并有LacZ+標(biāo)志基因作為篩選標(biāo)志，以供重組篩選，因而成為更為理想的重組病毒載體。鑒于PPV VP2基因的良好免疫原性，將其插入到PRV載體中，有望研制出理想的PPV—PRV二價(jià)重組基因工程疫苗。

（3）基因疫苗 基因免疫又稱(chēng)核酸免疫，是由Wolff和Felgner于1990年偶然發(fā)現(xiàn)的，直接將編碼有目的蛋白基因和表達(dá)調(diào)控序列的DNA或RNA注射到動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，利用機(jī)體的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，合成目的蛋白質(zhì)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種能夠在體內(nèi)表達(dá)外源蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的核酸稱(chēng)為核酸疫苗，包括DNA和RNA疫苗。由于基因疫苗具有易于構(gòu)建和改造，規(guī)?；a(chǎn)成本低廉，具有良好的熱穩(wěn)定性、可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，故被認(rèn)為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗，并被稱(chēng)作是“疫苗的第三次革命”。在1994年的世界衛(wèi)生組織會(huì)議上，與會(huì)專(zhuān)家一致認(rèn)為核酸疫苗將成為疾病防治中的又一個(gè)重要手段，特別是它將在一種疫苗預(yù)防多種疾病方面發(fā)揮作用。盡管對(duì)核酸疫苗進(jìn)行了理論和應(yīng)用方面的詳細(xì)探討，但是其作用機(jī)理目前尚未闡明。理論上認(rèn)為，迄今所有用于主動(dòng)免疫的第一、二代疫苗都可完善成效果更加理想的核酸疫苗。趙俊龍等進(jìn)行了有關(guān)PPV核酸疫苗的研究，動(dòng)物試驗(yàn)初步表明，以PPV結(jié)構(gòu)基因VP1和VP2分別構(gòu)建的核酸疫苗，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，比常規(guī)滅活疫苗產(chǎn)生的高。核酸疫苗的生產(chǎn)簡(jiǎn)便、成本低廉，也預(yù)示著其具有理想的應(yīng)用前景。（未發(fā)表）

（4）轉(zhuǎn)基因植物可飼(食)疫苗 轉(zhuǎn)基因植物可飼(食)疫苗是在二十世紀(jì)八十年代，利用植物基因工程技術(shù)創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。首先進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗研究的是Curtiss和Cardineau，他們以專(zhuān)利的形式發(fā)表了他們的第一篇報(bào)告。Mason等報(bào)道了在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)乙肝表面抗原，提出轉(zhuǎn)基因植物疫苗的概念，他們?cè)谘芯縃BSAg在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯沒(méi)有受到限制，不僅可以正常編碼蛋白，而且可以組裝形成類(lèi)病毒顆粒。正是基于這一點(diǎn)，我們認(rèn)為有望開(kāi)發(fā)出PPV轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗，因?yàn)镻PV的VP2基因表達(dá)后能自我形成類(lèi)病毒粒子，這對(duì)保持其免疫原性是非常重要的；另外，VP2基因表達(dá)的類(lèi)病毒粒子可以作為其它抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，這為開(kāi)發(fā)多價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了條件。