特異性卵黃抗體

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特異性卵黃抗體 來源:中國獸藥114網(wǎng) 編者:樂天 時(shí)間:2007-10-30 9:10:57 仔豬大腸桿菌性腹瀉是由豬致病性大腸桿菌引起的一種常見傳染病，具有發(fā)病急、傳播快。死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia colt，ETEC）是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌之一（Yokoyam等，1992）。長期以來，該病的防治主要依賴于抗菌藥物、大腸桿菌多價(jià)苗和基因工程疫苗。然而，抗生素在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致藥物殘留和產(chǎn)生抗藥性；用疫苗免疫母豬，雖可提高母乳中抗體含量，但母源抗體持續(xù)時(shí)間短，木足以保護(hù)仔豬整個(gè)生長階段不致??；口服高免動(dòng)物血清雖能有效防治該病，但成本較高很難在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。因此，尋找一種使用方便、成本低、綠色環(huán)保且能有效防治仔豬腹瀉的生物制劑已成為養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展中急需解決的問題。卵黃抗體亦稱卵黃免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin，IgY），是一種高效防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的生物制劑，利用蛋雞生產(chǎn)特異性卵黃抗體具有可規(guī)?；a(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高及安全性好等優(yōu)點(diǎn)（李國平等，200人目前，采用特異性卵黃抗體防治仔豬腹瀉已取得可喜進(jìn)展，本文就此作一簡述。IETEC引起仔豬腹瀉的致病機(jī)理及卵黃抗體抗ETEC感染的作用機(jī)理 ETEC引起仔豬腹瀉的主要致病原是具有宿主特異性的菌毛和腸毒素。首先，ETEC通過特異性菌毛吸附到小腸粘膜上皮細(xì)胞表面的受體上，這種牢固的結(jié)合使菌體能夠抵抗腸道蠕動(dòng)產(chǎn)生的沖刷作用從而定植下來。然后ETEC大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。研究證實(shí)，每個(gè)上皮細(xì)胞平均可粘附 K88＋（或 K99＋ ）ETEC 22．5～35．l個(gè)（李學(xué)伍 等，2001）。ETEC的特異性菌毛具有高度專一的粘附性，亦稱粘附素、粘著素或定植因子。引起仔豬腹瀉的ETEC特異性菌毛主要有K88、K99、987P、F41和 F18。ETEC的腸毒素分為耐熱腸毒素（heat stable enterotoxin，ST）和不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin，LT）兩種。阿是通過激活腸粘膜細(xì)胞表面的鳥音環(huán)化酶（GC），使胞內(nèi)CGMP含量增多從而導(dǎo)致腹瀉。LT由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成，A亞單位是毒素的活性部位，B亞單位與腸粘膜上皮細(xì)胞表面的GMI神經(jīng)節(jié)著脂結(jié)合后起到使A亞單位穿越細(xì)胞膜與腺音環(huán)化酶（AC）作用，促使胞質(zhì)內(nèi)CAMP水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致腸粘膜細(xì)胞內(nèi)水、鈉、氯、碳酸氫鉀等過度分泌至腸腔引起腹瀉（華榮虹等，2002a）. 卵黃抗體經(jīng)仔豬口服后有抗ETEC感染的作用，它能與特異性菌毛抗原結(jié)合，減少或阻斷菌毛粘附到仔豬腸道粘膜上皮細(xì)胞表面，使ETEC不能在小腸定居繁殖，從而不能分泌腸毒素防止了腹瀉的發(fā)生(Marquaalt等，1999)。 2 特異性卵黃抗體在防治仔豬大腸桿菌性腹瀉中的應(yīng)用 2．l 以 ETEC菌體為抗原徐福洲等（2002）利用ETEC的K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)菌株制備單價(jià)菌體油乳劑滅活苗，用以免疫產(chǎn)蛋母雞，瓊脂擴(kuò)散效價(jià)。1：64時(shí)收集卵黃，用提純后的卵黃抗體對(duì)攻毒的新生仔豬口服治療，結(jié)果顯示治療組仔豬腹瀉癥狀明顯減輕，與對(duì)照組相比有顯著差異：治療組未出現(xiàn)死亡病例，而對(duì)照組仔豬死亡率為33％～67％?？梢?，特異性 IgY對(duì) ETEC引起的仔豬腹瀉具有明顯的防治效果。李國平等（2002）用ETEC的K88、K99、987P和F41標(biāo)準(zhǔn)菌株制成多價(jià)菌體油乳劑滅活苗，對(duì)蛋雞免疫后收集高免卵黃，提純后精制成抗大腸桿菌特異性高免卵黃抗體并應(yīng)用于臨床。結(jié)果表明，每頭新生仔豬口服2～4mL該卵黃抗體可有效預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉，且安全性很好。高云英等（2003）用ETEC的K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)菌株和地方分離菌株制成多價(jià)菌體油乳劑滅活苗，免疫商品蛋雞，收集高免蛋制備多價(jià)卵黃抗體。經(jīng)預(yù)防、攻毒試驗(yàn)及臨床治療效果觀察，對(duì)新生仔豬免疫保護(hù)率可達(dá)90％以上，3日齡仔豬攻毒保護(hù)率達(dá)98％以上，3～11日齡仔豬臨床治愈率達(dá)95％以上。 2． 2 以ETEC的特異性菌毛為抗原 ETEC的特異性菌毛位于細(xì)菌表面，為非鞭毛的細(xì)絲狀附加物，長約0．2～1．3 μp（Mooi等，1985）。菌毛是ETEC的一個(gè)重要毒力因子，其成分為蛋白質(zhì)，化學(xué)本質(zhì)為菌毛蛋白亞單位，具有良好的抗原性（崔德風(fēng)等，2001）。各種菌毛對(duì)腸上皮細(xì)胞表面的粘附作用具有宿主特異性，并只能粘附于具有相應(yīng)受體的特定動(dòng)物的腸細(xì)胞上（見表1）。因此，用不同菌毛抗原免疫蛋雞可獲得相應(yīng)的特異性卵黃抗體。華榮虹等（2002）分別用 K88、K99、987P和F41菌毛蛋白苗對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，結(jié)果表明88免疫性最強(qiáng)且各菌毛單獨(dú)免疫后的抗體效價(jià)均高于混合菌毛苗免疫后相應(yīng)的抗體效價(jià)。他們還比較了由木同免疫佐劑（弗氏佐劑、白油性劑、氫氧化鋁膠、蜂膠）制備的K88佐劑苗的免疫效果，其中弗氏佐劑和白油性劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)高。持續(xù)時(shí)間長，是較合適的佐劑。 表1 ETEC的主要宿主特異性菌毛及其粘附位置 宿主特性菌 粘附位置 K88 只能粘附于仔豬十二指腸段 K99、987P 可粘附于初生豬、牛、羊的空腸 F41 只能粘附于仔豬回腸 注；資料來源于崔德鳳等（2001）。 Yokoyama等（1992）將提純的ETEC宿主特異性菌毛 K88、K99、987P制成單價(jià)菌毛蛋白苗，免疫蛋雞獲得卵黃抗體粉末，ELISA檢測結(jié)果表明，抗K88、K99、987P的卵黃抗體能夠特異性地與相應(yīng)的菌毛抗原作用，用卵黃抗體對(duì)不同ETEC菌株攻毒的新生仔豬進(jìn)行口服治療，治療組仔豬服用效價(jià)為625和2500的抗體后全部存活，而對(duì)照組仔豬死亡率超過80％。 含有K88菌毛的ETEC是引起仔豬腹瀉最主要的病原菌（Mmpwht等，1999）。在 K88＋ E．coli中，菌毛約占細(xì)菌蛋白質(zhì)的 1％（Middledorp等，1981）。 Jin等（1998）將一種 K88+ ETEC地方株培養(yǎng)后，提取和純化菌毛，將菌毛蛋白液（0．3mg/mL）與等量弗氏完全佐劑、弗氏不完全性劑充分乳化免疫蛋雞，收集高免卵黃井噴霧干燥制成卵黃抗體粉，體外試驗(yàn)表明，該卵黃抗體粉能阻礙K88+ ETEC粘附到豬小腸粘膜上，而且能迅速與E．coli菌株結(jié)合，15 min即可使仔豬獲得最大程度的免疫保護(hù)。Mapllwht等（1999）在此基礎(chǔ)上，采用同一抗原免疫母雞后獲得抗K88菌毛的卵黃抗體，用于治療 K88+ ETEC攻毒的新生（3日齡）和斷奶后（對(duì)日齡府豬，結(jié)果表明，新生仔豬用卵黃抗體治療后24h內(nèi)均被治愈，而用安慰劑（不含K88抗體的卵黃粉）治療的仔豬繼續(xù)腹瀉死亡率達(dá)62．5％；斷奶仔豬飼喂卵黃抗體后僅出現(xiàn)短暫腹瀉，未出現(xiàn)死亡病例且體重明顯增加，而對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉和脫水癥狀，且48 h內(nèi)即有仔豬死亡。在商業(yè)性豬場的飼糧中添加抗K88、K99菌毛的卵黃抗體，能降低早期斷奶（14～18日齡）仔豬的腹瀉發(fā)生率。 F18菌毛與斷奶后仔豬的腹瀉和水腫有關(guān)，現(xiàn)已知F18菌毛以F18ab小和F18ac。兩種菌毛抗原變異體形式存在(Imberechts等，1997)。研究表明，F(xiàn)18ab菌毛是引起仔豬水腫的大腸桿菌的主要毒力因子之一，而F18ac菌毛是引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC的一種菌毛抗原（嚴(yán)振龍等，200）。Zunigs等（1997）分別用 0．5 mgF18ab和 F18ac（干重）與等量含5 ％（v／v）Arlacel 80的乳化油充分乳化制備菌毛蛋白苗，免疫蛋雞，制成特異性卵黃抗體粉，試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng) F18ab+（或 F18ac+）E．coli攻毒的斷奶仔豬飼喂相應(yīng)抗體后，可獲得完全保護(hù)。 2．3 菌體與菌毛抗原免疫效果的比較 以菌體為抗原制備菌體疫苗，制作雖然方便但免疫效果不如菌毛抗原制備的菌毛蛋白苗。肖馳等（1998）分別以ETEC菌毛和滅活菌體為抗原制備了抗K88、K99、987P和F41的卵黃抗體，結(jié)果表明兩種卵黃抗體均有效，但菌毛蛋白苗免疫獲得的抗體效價(jià)要高于菌體疫苗免疫獲得的抗體效價(jià)。Kim等（1996）分別以ETEC的K88菌毛和減毒菌株作為抗原，對(duì)制備的卵黃抗體效價(jià)進(jìn)行了比較（見表2），結(jié)果表明前者免疫得到的抗體效價(jià)明顯高于后者，且抗體經(jīng)純化后效價(jià)顯著提高。 表 2 IgY純化前后卵黃中蛋白質(zhì)的濃度及抗體效價(jià) 在卵黃中的濃渡（mg/kg）抗體效價(jià) 蛋白質(zhì)（％） IgY（％） K88菌毛抗原免疫 純化前的卵黃 446（100） 18（100） 8600 純化后的卵黃 30（7） 14（81） 140000 減毒菌株免疫 純化前的卵黃 539（100） 18（100） 1800 純化后的卵黃 32（6） 15（81） 12000 注：資料來源于Kin等（1996）。 3 卵黃抗體抑制ETEC粘附的影響因素 Yokoyalna等（1992）應(yīng)用抗K88、K99、987P特異性卵黃抗體治療ETEC引起的新生仔豬腹瀉，認(rèn)為其治療效果取決于抗體的劑量。試驗(yàn)結(jié)果表明，受到 K88+、K99+、987P+ ETEC攻毒的仔豬，用效價(jià)為156的相應(yīng)抗體治療時(shí)死亡率分別為29％、50％和40 ％，而用效價(jià)為625和2500的相應(yīng)抗體治療時(shí)仔豬全部存活。Zunisa等（1997）在研究抗F18菌毛的卵黃抗體時(shí)也得出了類似結(jié)論。 Jin等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，卵黃抗體抑制ETEC粘附的影響因素是抗體的劑量和ETEC的濃度。小腸內(nèi)所含抗體必須達(dá)到一定劑量才能阻止E．coli粘附到小腸粘膜上皮細(xì)胞的受體上。K88+ E．coli為 109 cfu（colony－ forming units）／mL時(shí)，稀釋50和100倍的卵黃抗體對(duì)E．coli均有很強(qiáng)的抑制能力（粘附＜6％）；而K88+E．coli為1010Cfu／mL時(shí)，稀釋100倍的卵黃抗體不能有效阻止E．coli粘附到腸粘膜上。Mndt等（1999）研究表明，采用卵黃抗體進(jìn)行治療應(yīng)具有連續(xù)性，例如：每只仔豬每天飼喂1.5g的卵黃抗體能有效防治 1010 cfu/fmL ETEC引起的腹瀉，在飼糧中添加0．2 ％的卵黃抗體可預(yù)防商業(yè)性豬場中仔豬腹瀉。 4 展望 用特異性卵黃抗體防治仔豬大腸桿菌性腹瀉，不會(huì)影響腸道正常菌群的生長繁殖，不存在抗藥性和藥物殘留問題，同時(shí)也避免了懷孕母豬因注射疫苗引起的應(yīng)激反應(yīng)或仔豬母源抗體水平不足而導(dǎo)致的免疫喪失等問題，是一種安全高效的生物防治制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。