白頭翁素對(duì)LT致腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高的影響

貔貅

摘要：為了探討白頭翁在治療細(xì)菌性痢疾方面的藥理機(jī)制，通過體外培養(yǎng)腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用硝酸還原酶法檢測(cè)各試驗(yàn)組細(xì)胞上清液中NO含量，研究了白頭翁素對(duì)正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞和LT刺激后的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響。研究結(jié)果顯示白頭翁素對(duì)正常腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO無明顯影響，但可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高。表明白頭翁素抑制LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，是白頭翁素的重要藥理機(jī)制。
關(guān)鍵詞：微血管內(nèi)皮細(xì)胞；腸黏膜；LT；白頭翁素；NO
    白頭翁作為治療菌痢的要藥，其主要成分是白頭翁素。目前，對(duì)白頭翁素藥理機(jī)制的研究并不多見，一般認(rèn)為主要在于抑菌[1]，對(duì)于其它的藥理作用尚不得而知。越來越多的研究表明，細(xì)菌毒素是引起腹瀉的罪魁禍?zhǔn)祝?xì)菌毒素作用的主要靶細(xì)胞是腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞[2]。因此，阻斷細(xì)菌毒素對(duì)腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，為抗細(xì)菌病藥物的研究提供了新的思路和方法。熱敏腸毒素（LT）是產(chǎn)毒素性大腸桿菌釋放的主要毒素，可直接導(dǎo)致腹瀉。本試驗(yàn)在建立LT引起腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高病理模型的基礎(chǔ)上，研究了白頭翁素對(duì)其影響，以進(jìn)一步闡明白頭翁素的抗腹瀉機(jī)制。
1材料與方法
1.1主要材料與試劑
腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的第八代大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]。
完全培養(yǎng)基：在DMEM培養(yǎng)液中按比例加入以下成份：15% FBS（Hyclone）、0.584mg/ml谷氨酰胺（Sigma）、1×105U/L注射用青霉素（華北制藥股份有限公司）、0.1g/L注射用鏈霉素（華北制藥股份有限公司）。
維持培養(yǎng)基：添加5％FBS，其它成份同完全培養(yǎng)基。
LT ：由北京農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室制備、鑒定[4]。
白頭翁素：購自天津中醫(yī)藥研究所。
NO檢測(cè)試劑盒：購自深圳晶美生物工程公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)：

    選取第七代腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行傳代，平均接種于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜止培養(yǎng)。細(xì)胞定時(shí)計(jì)數(shù)，待數(shù)量增至1.0×105時(shí)，選取40孔細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組：
將細(xì)胞按以下方案分為四組。
對(duì)照組：用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
LT組：用含有10mg/ml LT的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
白頭翁素組：用含有5mg /ml白頭翁素的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；
LT＋白頭翁素組：用含有10mg/ml LT的維持培養(yǎng)基培養(yǎng)1h后，再添加白頭翁素繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2.3樣品采集和NO測(cè)定
    各組細(xì)胞分別培養(yǎng)3h、6h后，依次收集培養(yǎng)上清液（每組收集5孔），3000rp/m離心10min后，分別收集于小離心管中。按NO檢測(cè)試劑盒（硝酸還原酶法）操作說明，于530nm處檢測(cè)各樣品OD值，按公式計(jì)算NO水平。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
    各組細(xì)胞分泌NO的量見附表，由表可知：（1）在3h和6h內(nèi)，LT組細(xì)胞分泌NO量均極顯著高于對(duì)照組；（2）在3h和6h內(nèi)，白頭翁素組細(xì)胞分泌NO的量與對(duì)照組之間差異均不顯著；（3）在3h和6h內(nèi)，LT＋白頭翁素組細(xì)胞分泌NO量均極顯著低于LT組。
    以上結(jié)果表明：10mg/ml LT可刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高；10mg/ml白頭翁素對(duì)正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌無明顯影響；5mg /ml白頭翁素可顯著抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高。

附表.白頭翁素對(duì)LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響（±sμmol/L ，n=5）

Table: The effect of anemones on the level of NO in the rat intestinal mucous microvascular endothelial cells exposed under LT. （±sμmol/L ，n=5）

組別	劑量 mg/ml	3hNO μmol/L	6hNO μmol/L
對(duì)照組	0	21.43±1.34	16.60±1.26
LT組 白頭翁素組 LT＋白頭翁素組	10 5 10＋5	26.68±1.18* 21.22±2.18** 17.54±1.47Δ	34.77±1.43* 16.46±1.43** 16.39±1.01Δ

（在同一時(shí)間段，與對(duì)照組比較 *P<0.01，**P>0.05，與LT組比較ΔP<0.01。）
3．討論：
    LT是產(chǎn)毒素性大腸桿菌的主要毒力因子，以往的研究都集中于LT對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞功能的影響，并認(rèn)為上皮細(xì)胞是LT的特異性靶細(xì)胞[5]。隨著對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的不斷深入，人們開始逐漸認(rèn)識(shí)到腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)菌毒素引起的腸道疾病中起十分重要的作用。有人認(rèn)為，由細(xì)菌毒素引起的腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)異常，如微血管通透性增加、中性粒細(xì)胞聚集及微血管收縮等，是導(dǎo)致腸炎的重要致病機(jī)制[6]?？紤]到腸黏膜微血管緊接上皮細(xì)胞層，是循環(huán)系統(tǒng)的末端，其通透性升高是導(dǎo)致黏膜水腫和水鹽流入腸腔的前提，因此，我們推測(cè)，腸毒素除了損傷腸黏膜上皮細(xì)胞，甚至更為重要的是損傷到腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞，引起腸道通透性升高，從而導(dǎo)致腹瀉。本試驗(yàn)結(jié)果LT能顯著刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高，結(jié)合NO的增加微血管通透性效應(yīng)，證實(shí)了我們的觀點(diǎn)。
    白頭翁是治療細(xì)菌性痢疾的重要中藥，對(duì)其有效成分作用機(jī)理的研究無疑有助于臨床用藥。本試驗(yàn)調(diào)查了白頭翁素對(duì)正常培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及對(duì)LT刺激后的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響。結(jié)果表明，5mg /ml白頭翁素對(duì)正常腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO無明顯影響，但可抑制LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高。推測(cè)這種抑制作用，可通過以下4種途徑實(shí)現(xiàn)：①直接破壞LT的活性結(jié)構(gòu)；②與LT競(jìng)爭(zhēng)腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞上的受體；③參與LT刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌NO的中間過程；④直接影響NO的分泌。從LT對(duì)正常培養(yǎng)腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO無明顯影響的結(jié)果，可以排除④的可能性，但確切的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。據(jù)研究報(bào)道，NO可作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[7]，因此可以推論，白頭翁素對(duì)LT引起的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。這對(duì)于防止腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受LT造成損傷和防治大腸桿菌病具有重要意義。