黃連解毒散超微細(xì)粉中黃芩苷在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

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超微粉碎是近年來(lái)國(guó)際上發(fā)展非常迅速的一項(xiàng)新技術(shù)，應(yīng)用這種技術(shù)可將固體物料粉碎成直徑小于10μm的粉體。粉碎是中藥生產(chǎn)和制備各種劑型的基本操作，而超微粉碎的細(xì)胞破壁率特別高，大于95%，所以將它應(yīng)用于中藥制劑的制備中，可大幅度地提高藥材中有效成分的釋放和在體內(nèi)的吸收，提高中藥制劑的生物有效性[1,2]。故此，不少業(yè)內(nèi)專(zhuān)家認(rèn)為，超微粉碎技術(shù)在中藥加工上的應(yīng)用研究，將帶來(lái)中藥行業(yè)的新一輪的技術(shù)革命。

　　黃連解毒湯出自王燾《外臺(tái)秘要》，本方由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成。具有清熱瀉火解毒之功效，主治一切實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。無(wú)論內(nèi)服、外用具有良好的治療作用[3-5]?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》（2000年版）中的黃連解毒散即源于本方。據(jù)研究，本方具有一定的抗菌、解毒、耐缺氧、抗自由基等作用。在獸醫(yī)臨床上，本方廣泛應(yīng)用于敗血癥、膿毒血癥、痢疾等各種急性炎癥[6]。

　　黃一帆等 [7]已對(duì)中藥方劑黃連解毒散進(jìn)行普通粉碎和超微粉碎后的粉末形態(tài)學(xué)進(jìn)行了比較觀察，利用掃描電鏡、生物顯微鏡、激光粒度測(cè)定儀對(duì)普通粉和超微細(xì)粉進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)藥材經(jīng)超微粉碎后，粉末顆粒細(xì)微均勻，顆粒的球性度提高，復(fù)方均質(zhì)度明顯改善，絕大多數(shù)細(xì)胞破壁。黃芩苷是黃連解毒散黃芩中主要的有效成分，與黃芩的清熱解毒，燥濕等功效有十分密切的關(guān)系。藥理研究表明黃芩苷具有抗菌、抗病毒、降壓、保肝、解毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[8]，體外溶出度試驗(yàn)[9]表明超微粉碎可提高黃連解毒湯中黃芩苷溶出量。對(duì)該方進(jìn)行超微粉碎后有效成分黃芩苷在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本文在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法測(cè)定家兔體內(nèi)黃芩苷的血藥濃度，比較黃連解毒散超微細(xì)粉、細(xì)粉中黃芩苷在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期揭示黃連解毒散經(jīng)超微粉碎后主要成分在體內(nèi)的變化規(guī)律及其生物利用度，為黃連解毒散超微粉在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

　　1．材料和方法

　　1．1試驗(yàn)動(dòng)物

　　10只健康家兔（購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），公母各半，體重2.5～3.0kg。單籠飼養(yǎng)，自由飲水。

　　1．2 主要試驗(yàn)儀器

　　美國(guó)Agilent公司1100型高效液相色譜儀；HSC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；BMF-6型倍力超微粉碎機(jī)（濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司）；FZ-102型植物試樣粉粹機(jī)（河北黃驊市家務(wù)科學(xué)儀器廠）；Statorius BS210S型電子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；AL104型電子天平（西德）；TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

　　1．3藥材與試劑

　　黃連解毒散由黃連、黃柏、黃芩和梔子(購(gòu)于福州市藥材采購(gòu)供應(yīng)站)按規(guī)定比例混合而成。黃連解毒散細(xì)粉由植物試樣粉碎機(jī)粉碎，過(guò)65目篩。黃連解毒散超微細(xì)粉由濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司采用超微粉碎技術(shù)制成。試驗(yàn)前40℃減壓干燥至恒重，給藥前用蒸餾水配成懸浮液。

　　黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)10715-200212）；甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司 ）；磷酸為分析純（廣東光華化學(xué)廠有限公司）；肝素鈉（上?；菖d生化試劑有限公司）。

　　1．4 給藥與血樣采集

　　10只家兔試驗(yàn)前根據(jù)性別、體重隨機(jī)分為2組，即黃連解毒散細(xì)粉組和黃連解毒散超微細(xì)粉組，按4g·kg-1劑量灌胃給藥，給藥前禁食12h，于給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6、8、12、24h頸靜脈采血2.5mL, 肝素鈉抗凝。3000r/min，離心15min，分離血漿，分裝于eppendorf管中，-20℃保存待測(cè)。

　　1．5 血漿中黃芩苷濃度的測(cè)定

　　1．5．1樣品處理

　　精密吸取各時(shí)間點(diǎn)的含藥血漿0.2mL于離心管中，加1.4mL甲醇超聲振蕩15min，旋渦振蕩1min，12000r/min離心15min，取上清液到另一干凈的離心管，40℃水浴氮?dú)饬鲹]干，殘?jiān)?.25mL流動(dòng)相溶解，并旋渦振蕩2min，超聲5min，0.45μm濾膜過(guò)濾，最后取20μL進(jìn)樣。

　　1．5．2標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　精密稱(chēng)取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，加流動(dòng)相配成10μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL置10mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配制成1μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液精密吸取6、12、24、36、50、100μL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1μg/mL）于離心管中，40℃水浴氮?dú)饬鲹]干，分別加入空白血漿0.2 mL，得不同濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)液（濃度分別為0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.12μg/mL、0.18μg/mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL），按“樣品處理”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣。得到回歸方程為：y=39.849x+0.467（r=0.9994）；在0.03～0.5μg/mL之間線性關(guān)系良好。以信噪比 S/N 為3 計(jì)，該方法的檢測(cè)限為0.02μg·mL-1。

　　1．5．3回收率的測(cè)定

　　用空白血漿和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制0.03μg/mL、0.18 μg/mL、0.5μg/mL黃芩苷血漿樣品，每種濃度樣品數(shù)n=5，按“樣品處理”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣分析，測(cè)得高 、中、 低 3 個(gè)濃度水平血漿中黃芩苷的回收率和 RSD分別為75.96％、78.07％、78.85％和4.29％、4.57％、4.38％。

　　1．5．4精密度的測(cè)定

　　用空白血漿和黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制0.025μg/mL、0.15μg/mL、0.4μg/mL黃芩苷血漿樣品，每種濃度5份，按“樣品處理”項(xiàng)下方法處理，測(cè)得高、 中、 低 3 個(gè)濃度水平血漿中黃芩苷的日內(nèi) RSD 分別為4.66 %、3.16%、 4.22% ，日間 RSD 分別為 4.71% 、3.90% 、4.68%。

　　1．5．5色譜條件? 色譜柱為Hanbon 1C18254F（4.6mm×250mm） ；流動(dòng)相為甲醇-水-0.2%磷酸(55：45：0.2)；流速1m1／min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。 黃芩苷的保留時(shí)間為8.4～8.7 min。黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、空白血漿、空白血漿加黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品、家兔灌藥血漿樣品的色譜圖如圖1-5。

圖1　黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2　空白血漿色譜圖

圖3　血漿中黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖4　家兔灌胃HLJDS 細(xì)粉血漿黃芩苷色譜圖

圖5　家兔灌胃HLJDS超微細(xì)粉血漿黃芩苷色譜圖

　　2．結(jié)果

　　2．1家兔口服黃連解毒散后的黃芩苷血藥濃度結(jié)果見(jiàn)表1，圖6。

　　表1　家兔黃芩苷血藥濃度（n=5，μg /mL）

采血時(shí)間(h) Time/h	黃連解毒散細(xì)粉 Common powder	黃連解毒散超微細(xì)粉? Ultra micro-powder???????????????????
0.25	0.06250±0.00872	0.0936±0.01530
0.5	0.07326±0.00888	0.113335±0.01310
0.75	0.094397±0.01040	0.133667±0.01340
1	0.107155±0.00688	0.157588±0.00708
1.5	0.152605±0.01050	0.274003±0.00611
2	0.201642±0.01600	0.321246±0.01560
2.5	0.218985±0.01750	0.319054±0.01630
3	0.217789±0.01750	0.315465±0.02250
4	0.211809±0.01790	0.274202±0.01870
6	0.179914±0.02100	0.254069±0.01600
8	0.167156±0.02360	0.175379±0.01600
12	0.073865±0.00551	0.078849±0.00610
24	0.038383±0.00552	0.035791±0.00998

　　

圖6　黃芩苷超微細(xì)粉和細(xì)粉藥時(shí)曲線圖

　　2．2家兔內(nèi)服黃連解毒散的藥帶代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

　　將兩組給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采血測(cè)得的血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)的均值，采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件PKS(Pharmaceutical Kinetics Software)處理藥時(shí)數(shù)據(jù)，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 家兔內(nèi)服黃連解毒散（4g/kg）后血漿黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

參數(shù) Parameter	單位 Unit	黃連解毒散細(xì)粉 Common powder	黃連解毒散超微細(xì)粉 Ultra micro-powder
A	μg /mL	0.414	0.990
α	1/h	0.252	0.271
B	μg /mL	0.323	0.171
β	1/h	0.119	0.0819
Ka	1/h	0.419	0.497
t1/2α	h	2.74	2.556
t1/2β	h	5.83	8.46
Vd	L·kg-1	12.890	6.752
AUC	（μg /ml).h	2.611	3.401
K10	1/h	0.152	0.174
K21	1/h	0.197	0.128
K12	1/h	0.0222	0.0514
Tpeak	h	3.645	3.005
Cmax	μg /mL	0.215	0.311

　　3．分析與討論
　　由于黃芩苷的結(jié)構(gòu)為5，6二羥基黃酮-7-0葡萄糖醛酸苷，易氧化，須在低溫下進(jìn)行，所以，在用氮?dú)獯蹈蓵r(shí)，采用了較低的水浴溫度40℃，而不是常用的50-60℃。黃芩苷極性較大，且有一定的酸性，為了防止其拖尾，加入磷酸抑制其解離，起到改善峰形的作用。何心等[10]用高效液相色譜電化學(xué)法測(cè)定雙黃連中黃芩苷的血藥濃度，直接用乙腈沉淀蛋白，在本次試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取法的回收率比乙腈超聲提取法高一倍，說(shuō)明了用甲醇提取比用乙腈好，這可能是因?yàn)橹兴幱行С煞值难帩舛榷己艿?，在ng和μg級(jí)，因而對(duì)提取方法敏感，而甲醇沉淀蛋白是成絮狀的、乙腈沉淀蛋白是成小塊狀的，絮狀的更有利于藥物的溶出，因此，用甲醇更有利于低血藥濃度藥物的提取。本試驗(yàn)在此色譜條件下測(cè)得的黃芩苷精密度好，回收率高，血藥有效成分峰和雜質(zhì)峰分離清楚,靈敏度高，說(shuō)明該方法穩(wěn)定，快速準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便可行，可以作為本試驗(yàn)血藥濃度監(jiān)測(cè)的手段。
　　本試驗(yàn)所得血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)藥代動(dòng)力學(xué)軟件PKS(Pharmaceutical Kinetics Software)處理藥時(shí)數(shù)據(jù)，根據(jù)F檢驗(yàn)和AIC值選擇房室數(shù)，2組家兔口服黃連解毒散超微細(xì)粉、細(xì)粉后，其有效成分黃芩苷在其體內(nèi)的代謝過(guò)程符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型。說(shuō)明黃連解毒散超微細(xì)粉和細(xì)粉的有效成分黃芩苷在家兔體內(nèi)的代謝方式基本相似。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]家兔口服銀黃沖劑，銀黃沖劑中的代表成分黃芩苷在家兔體內(nèi)的藥時(shí)過(guò)程也符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放模型，但其消除非常緩慢，消除半衰期達(dá)到341.5 h，與本試驗(yàn)的5.83-8.46 h相比，差異很大，這可能與試驗(yàn)方劑的不同有關(guān)，黃連解毒散中含有利膽作用較強(qiáng)的梔子，這種成分可能對(duì)黃芩苷的排泄產(chǎn)生某些顯著影響，因?yàn)辄S芩苷是含羥基的黃酮類(lèi)化合物，極性較強(qiáng)，有利于血中的快速消除，而且黃酮類(lèi)化合物的膽汁排泄是其排泄的主要途徑[12]。
　　黃連解毒散超微細(xì)粉組和細(xì)粉組比較，Tpeak縮短了0.640h； Cmax提高了43.98%；AUC反映藥物的生物利用度，其中超微細(xì)粉、細(xì)粉AUC分別是3.401 (μg·h /mL) 和 2.611(μg·h /mL)，與細(xì)粉比較，黃連解毒散超微細(xì)粉中黃芩苷的相對(duì)生物利用度提高了30.26%，表明超微細(xì)粉比細(xì)粉生物利用度大。一般對(duì)固體藥物來(lái)說(shuō)，溶出是吸收的前提，藥物粉體粒徑越小，比表面積越大，溶出越快，吸收越好[13]。在理論上，散劑的粒子越細(xì)，比表面積愈大，進(jìn)入體內(nèi)的粒子與體液較大的接觸面積，可使藥物較快的溶解和吸收。中藥經(jīng)過(guò)超微粉碎后，使細(xì)胞破壁率達(dá)95%以上，顆粒細(xì)、混合均勻，其有效成份充分暴露出來(lái)，在胃液作用下即被溶解，進(jìn)入小腸后一開(kāi)始即被同步吸收，起效迅速；另外，中藥超微細(xì)粉因其超微粉粒子吸附力的作用，使藥物在消化道內(nèi)的作用時(shí)間較長(zhǎng)，提高了藥物吸收率，同時(shí)藥物有效成份由細(xì)胞內(nèi)向外遷移所需時(shí)間短，吸收明顯加快且吸收量增大、吸收更完全[14-16]。藥物的生物利用度與藥物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相關(guān)性，因此通過(guò)降低藥物粉體的粒徑可改善藥物的溶出速度，提高生物利用度。本實(shí)驗(yàn)研究表明中藥經(jīng)超微粉碎后其有效成分可更快、更多的吸收，對(duì)提高中藥有效成分的生物利用度具有積極的意義。

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中藥的預(yù)防作用是毋庸置疑的