菊粉酶研究進(jìn)展及應(yīng)用

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菊粉酶研究進(jìn)展及應(yīng)用

菊粉最早是從菊科植物中分離出來而得名。菊粉（inulin）是一種有呋喃構(gòu)形的d一果糖經(jīng)β-2，l糖苷鍵脫水聚合而成，且在果糖殘基（f）末端連有一個(gè)葡萄糖殘基（g）的直鏈結(jié)構(gòu)多糖，是最簡單的一類果聚糖，簡寫為gfn（edelman等，1968）。此外，emst等（1995）報(bào)道，菊粉還含有少量另一類果聚糖（inulonose）即末端無連有g的果聚糖。

菊粉酶（inulinase）是能夠水解β－2，l－d一果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學(xué)名β－2，l－d一果聚糖酶，又叫β一果聚糖酶，2，l－d一果聚糖水解酶（ec3．2．l）。分泌菊粉酶的微生物在自然界中分布很廣，土壤、水和動(dòng)物消化道中的多種微生物都能分泌。菊粉酶可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖或低聚果糖。

菊粉酶有不同的分類方法。

根據(jù)菊粉酶在微生物體內(nèi)主要分布于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞壁和細(xì)胞外，分別稱為胞內(nèi)酶、胞壁結(jié)合酶和胞外酶，它們的比例主要受菌種、碳源、溫度和ph的影響（ettalibi等，1990）：l）隨著溫度的升高胞外酶比例下降，而其他兩種酶比例上升；2）以菊粉或蔗糖為碳源培養(yǎng)微生物時(shí)，前者胞外酶比例高于后者，其他兩種酶則相反；3）胞外酶主要由真菌合成，細(xì)胞壁結(jié)合酶主要產(chǎn)自酵母；4）適當(dāng)?shù)?/font>ph使細(xì)胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他兩種酶比例下降。

根據(jù)作用底物方式的不同，或者說根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內(nèi)切酶（ec3．2．1．7）和外切酶（ec3．2．1．80）。通常用i/s的大小來區(qū)分內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶，i是以菊粉作底物時(shí)的酶活，s是以蔗糖作底物時(shí)的酶活。一般認(rèn)為外切菊粉酶的i/s值比內(nèi)切菊粉酶的us低。內(nèi)切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖，常由真菌分離出來。外切菊粉酶在胞內(nèi)、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高純度果糖。

根據(jù)來源菊粉酶可以分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶。

2．l熱穩(wěn)定性絕大多數(shù)報(bào)道中，菊粉酶的最適溫度為52～64℃之間，55～58℃最適宜。

2．2ph值對活力的影響菊粉酶最適ph為弱酸性，這一性質(zhì)不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的ph值。

2．3底物專一性李俊剛等（1999）認(rèn)為，提高菊粉酶酶解效率的關(guān)鍵在于提高酶活和增加底物對酶作用的敏感性。據(jù)研究報(bào)道，菊粉酶不僅可以對菊粉作用，也可以對蔗糖及棉子糖作用，并表現(xiàn)出更高的活力和水解能力。使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導(dǎo)產(chǎn)生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。這可能是因?yàn)樘崛∫撼辗弁?，還含有較多的短鏈的多聚果糖，更有利于菌體的生長以及被酶水解（pramod等，1991）。也就是說，一定的底物可以誘導(dǎo)生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物對酶的活性影響很大。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導(dǎo)生成菊粉酶，淀粉對菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性。表明菊粉酶有底物專一性。

菊粉酶的來源很廣，自然界中的植物以及土壤、水和動(dòng)物消化道中的多種微生物都可以分泌菊粉酶。微生物來源的菊粉酶種類多，熱穩(wěn)定性好，適于發(fā)酵生產(chǎn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)菊粉酶的有絲狀真菌17個(gè)屬物余種，酵母菌10個(gè)屬20余種，細(xì)菌12個(gè)屬10余種。目前有不少研究人員仍在致力于篩選新的產(chǎn)酶菌種，并對現(xiàn)有菌種進(jìn)行改造，以得到高酶活、熱穩(wěn)定性好的生產(chǎn)菌株。大多數(shù)微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶，并且常常呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活力，轉(zhuǎn)化酶是一種水解蔗糖為葡萄糖和果糖的酶，對葡粉沒有作用。

菊粉酶的純化步驟一般分為：（nh4）2so4沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶，通常用naci進(jìn)行線性梯度洗脫，隨著na－ci濃度增加，內(nèi)切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出（azhall等，1989）。菊粉酶的提純過程：在0℃條件下，用40%飽和硫酸銨除雜蛋白，用90%飽和硫酸鉸析出菊粉酶，用sephadexg25脫鹽，聚乙二醇透析濃縮；再進(jìn)行sophadexg200層析，操作溫度10℃；然后進(jìn)行deae一纖維素de52離子交換層析；最后4℃、120v恒壓電泳分離（賈英民等，1998）。

常見的酵母和真菌中分離的酶多同時(shí)具有菊粉酶和轉(zhuǎn)化酶活性，為區(qū)分兩者，人們常采用“e＝菊粉酶總酶活+轉(zhuǎn)化酶總酶活”的公式，當(dāng)e＞0．02為菊粉酶，e＜0．02則為轉(zhuǎn)化酶。菊粉酶酶活定義為在一定的反應(yīng)條件下每分鐘釋放lμmol果糖所需酶量；轉(zhuǎn)化酶酶活定義為每分鐘水解1μmol蔗糖所需的酶量。由于目前測定菊粉酶酶活的定義沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此酶活的單位也有不同。

6．l酶液的制備胞外菊粉酶粗酶液的制備：將發(fā)酵液過濾或離心即可得粗酶液。胞內(nèi)菊粉酶粗酶液的制備：取一定量的發(fā)酵液離心后得菌體，將菌體用0．lmol/lph值為5．6的醋酸緩沖液洗滌2～3次后，加緩沖液至原體積，然后用超聲波處理（10khz，100w，5min）菌懸液，處理液即為胞內(nèi)菊粉酶粗酶液（肖春玲，1999）。

6．2酶活測定黎明蘭等（1995）用菊芋提取液做培養(yǎng)基。發(fā)酵后取0．05ml發(fā)酵液加4．5ml5%菊粉液，55℃反應(yīng)30min，沸水浴煮10min終止酶活，在同樣的反應(yīng)系統(tǒng)和條件下加入沸水浴煮10min的酶作空白對照。取一定量反應(yīng)液用費(fèi)林試劑熱滴定法測糖（北京大學(xué)生物系生物生化教研室，1986）。酶活單位定義為：在上述反應(yīng)條件下生成lμmol/min還原糖所需酶量為1個(gè)酶活單位。

uhm等（1987）報(bào)道的方法是，取50μl適當(dāng)稀釋的酶液，加入450μl5%的菊粉（0．lmol、ph4．5的醋酸緩沖液配制），60℃保溫10min，沸水浴5min，滅活終止反應(yīng)（在完全相同的條件下滅活酶底物作對照），快速冷卻后，用somogi-nelson法（derycke等，1984）測定還原糖。陳曉明等（2000）測定酶活時(shí)與uhm的方法不同的是，用3、5－二硝基水楊酸比色法測定還原糖數(shù)量，酶活單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化菊糖水解生成lμmol還原糖的酶量。

7．l利用菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿由于高果糖漿價(jià)格低廉，味甜，爽口，滲透壓高，保藏效果好，熱值低，不易造成齲齒，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等發(fā)達(dá)國家被廣泛用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。20世紀(jì)70年代以后，各國開始關(guān)注以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。酸法雖然產(chǎn)量高，但副產(chǎn)物多，色素重，分離精制難。80年代，美國、法國人b利時(shí)、加拿大等國的研究人員開始研究利用菊粉酶制果糖，其工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物純，果糖產(chǎn)量高，可直接生產(chǎn)超高果葡糖漿（uhfgs），果糖含量90%以上。為此美國、英國、丹麥、法國、加拿大等發(fā)達(dá)國家都在進(jìn)行研究。由此可見菊粉酶在果糖及果葡糖漿的生產(chǎn)上具有巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力。外切菊粉酶降解產(chǎn)物以果糖為主且果糖比例高。菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿的研究國內(nèi)外都較多，我國對其研究還處于起步狀態(tài)。

7．2利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)形成、提高機(jī)體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、降低膽固醇等作用，同時(shí)適于糖尿病人食用。比利時(shí)orafti公司投資20億比利時(shí)法郎，歷時(shí)數(shù)十年種植菊藝開發(fā)生產(chǎn)低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品（胡學(xué)智，1997）。日本明治制果也在大規(guī)模生產(chǎn)。中國食品發(fā)酵研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所等已經(jīng)試制成功，正在擴(kuò)大試驗(yàn)中。工業(yè)上生產(chǎn)利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖的方法是由內(nèi)切型菊粉酶水解菊粉而成，產(chǎn)物以低聚果糖為主，純度高，原料便宜，低聚果糖已被視為食品原料，而非食品添加劑。

7．3利用菊粉酶生產(chǎn)酒精利用菊粉酶生產(chǎn)酒精，國外相關(guān)研究較多。國外有報(bào)道指出，用aa-pergillusniger（schorr-garlindo等，1995）、k．fragilis（ohta等，1993）或k．margaritis（margantis等，1982）發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精，aspergll。niger轉(zhuǎn)化率為明%以上（v/v），后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。發(fā)酵粗菊芋提取液，不需加其他營養(yǎng)物質(zhì)，25h內(nèi)酒精產(chǎn)量87．8%。

7．4其他方面的應(yīng)用菊粉酶還可直接發(fā)酵菊粉制備各種產(chǎn)品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高。另外，嚴(yán)奉偉等（1999）已經(jīng)開始進(jìn)行菊粉軟糖的試制。利用菊粉酶直接發(fā)酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產(chǎn)開發(fā)潛力。

我國在菊粉酶的研究和應(yīng)用中遇到的主要困難是：l）產(chǎn)酶成本高，導(dǎo)致應(yīng)用成本高。主要表現(xiàn)在產(chǎn)酶菌株的菊粉酶產(chǎn)量低，提高了應(yīng)用成本，制約了低聚果糖在食品工業(yè)和飼料工業(yè)中的應(yīng)用。2）菊粉酶酶活測定及酶活力單位在定義上不統(tǒng)一，不利于研究者之間的交流和溝通。酶活力的測定方法對確定菊粉酶活力水平、特異性及歸類有重要意義。但目前在菊粉酶活力測定方法及酶活力單位定義上尚未統(tǒng)一。多數(shù)菊粉酶活力測定報(bào)道，是以不同聚合度、純度和濃度的菊粉或蔗糖做底物，測定反應(yīng)混合物在一定時(shí)間內(nèi)還原糖的增加量。另外，內(nèi)切型菊粉酶的酶解產(chǎn)物多為低聚果糖和少量果糖，所以按現(xiàn)有的酶活測定法及酶活定義，其酶活水平將普遍比外切型菊粉酶低。因此測定和活力單位定義標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一是急需解決的問題。

韓冰

好好，有個(gè)同學(xué)正在做這方面的實(shí)驗(yàn)。