甘露聚糖酶檢測(cè)方法！

gentech

甘露聚糖酶活性的檢驗(yàn)方法

原理 甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖. 應(yīng)用二硝基水楊酸分光光度計(jì)法測(cè)定還原 糖的釋放量. 活性單位 1甘露聚糖酶單位(MNU) 是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下, 1秒鐘內(nèi)從一定濃度甘露聚糖溶液中釋放具有還原能力相當(dāng)于1納摩爾甘露糖所需酶的量。 適用范圍 本方法適合于含有產(chǎn)自木霉的甘露聚糖酶的酶制劑樣品的測(cè)定. 安全 DNS試劑對(duì)人體有害, 防止吸入, 與皮膚及眼接觸. 試驗(yàn)條件 底物: 半乳甘露聚糖 PH : 5.3 溫度: 50°C ± 0.5°C 時(shí)間: 5 分鐘 儀器 水浴鍋 50°C 水浴鍋 100°C 試管混勻器 分光光度計(jì) 試劑 所有溶液均用非離子水配制. 1. 檸檬酸緩沖液(0.05M, PH 5.3) 將10.5克檸檬酸(C6H8O7×H2O, Merk244) 溶入約800毫升水中, 用 1M NaOH調(diào)整PH為5.3 (消耗量約為110ml). 在容量瓶中定容1000毫升. 2. 底物- 0.3%半乳甘露聚糖 將0.6g 槐兒豆膠(Sigma G-0753)溶解于 60°C檸檬酸緩沖液中,用廚 房混合機(jī)混勻.在磁振動(dòng)加熱器上加熱至沸點(diǎn). 在冷房?jī)?nèi)(2-8°C)攪 動(dòng)冷卻至室溫, 并使其過(guò)液溶解. 離心(10000轉(zhuǎn)/分鐘, 10分鐘) 除去不 溶性沉淀物, 加入檸檬酸緩沖液定容至200毫升. 在 -20°C冷凍儲(chǔ)存, 用沸水水浴鍋解凍并升溫至80°C. 3. DNS 試劑 將50.0克 3,5-二硝基水楊酸溶入約4升水中. 在連續(xù)磁振動(dòng)條件下, 逐漸加入80.0克 NaOH 并使其溶解. 加入1500克酒石酸鉀鈉(Merck, 8087). 溶液可能升溫至最大45°C. 冷卻至室溫并加水定容至5000毫升. 如果溶液混濁, 用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾. 在室溫下儲(chǔ)存于深色瓶中. 樣品 樣品用檸檬酸緩沖液稀釋. 合適的稀釋度為在反應(yīng)后的吸光度為0.10-0.40. 試驗(yàn) 在兩只試管中各加入1.8毫升底物溶液并在50°C平衡5分鐘. 向一支試管加入200微升樣品稀釋液并混勻. 在準(zhǔn)確5分鐘后, 向每只試管加入3.0 毫升DNS試劑并混勻.在不含樣品的試管(對(duì)照)加入200微升樣品溶液. 將兩只試管從水浴中取出立即放入開(kāi)水浴中. 準(zhǔn)確5分鐘取出用冷水冷卻至室溫. 在540nm測(cè)定樣品(相對(duì)于對(duì)照)的吸光度. 從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出活性并乘以稀釋倍數(shù). 標(biāo)準(zhǔn) 制備20 mM 甘露糖儲(chǔ)存液. 溶解360毫克甘露糖(Sigma M-6020) 于帶刻度的燒瓶中, 用檸檬酸緩沖液溶解并定容至100毫升. 儲(chǔ)存液可 在-20°C儲(chǔ)存, 解凍后混勻. 儲(chǔ)存液用檸檬酸緩沖液稀釋配制成以下稀釋液.

稀釋液	緩沖液 (ml)	甘露糖 mmol/ml	甘露聚糖酶活性 MNU/ml
1:1.5 1:3 1:5 1:7	8.5 7 5 3	3 6 10 14	10 20 33.3 46.7

將每種標(biāo)準(zhǔn)稀釋液用同樣方法做重復(fù)試驗(yàn): 吸取1.8毫升底物, 在50°C培養(yǎng)5分鐘, 加入3毫升DNS和200微升標(biāo)準(zhǔn)稀釋液. 對(duì)照的制備: 加入200微升緩沖液, 不加標(biāo)準(zhǔn)稀釋液. 煮沸試管準(zhǔn)確5分鐘, 冷卻至室溫. 在540nm 測(cè)定相對(duì)于對(duì)照的吸光度. 繪制吸光度相對(duì)于甘露聚糖酶活性(MNU/ml)的曲線. 根據(jù)每次測(cè)試, 繪制一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)線. 乘以甘露糖的稀釋倍數(shù)1000再除以反應(yīng)時(shí)間(300秒), 即得出甘露聚糖酶活性(MNU/ml).

sherier

是行標(biāo)了嗎？？:hehe: