豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素、外膜脂蛋白的表達及重組蛋白的純化

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摘　要：將構(gòu)建保存的重組表達質(zhì)粒pETApxⅠA、pETApxⅢA和pPRoAppOML1用IPTG誘導(dǎo)表達，選擇最佳的表達條件為IPTG 1.0 mmol/L，溫　　摘　要：將構(gòu)建保存的重組表達質(zhì)粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1用IPTG誘導(dǎo)表達，選擇最佳的表達條件為IPTG 1.0 mmol/L，溫度為37 ℃，表達時間為8 h，表達產(chǎn)物用SDS-PAGE鑒定，分別表達41、41、45 ku的蛋白，與預(yù)期蛋白大小一致。將表達產(chǎn)物用試劑盒進行純化，得到較好的目的條帶，并對其進行Western blot檢測，經(jīng)過分析，pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA表達產(chǎn)物具有較好的免疫反應(yīng)性。
　　關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌；表達；純化；免疫反應(yīng)性
　　豬傳染性胸膜肺炎是一種高度接觸傳染致死性呼吸道傳染病。急性和亞急性病例以纖維素性出血性胸膜肺炎，慢性病例以纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征[1]。近年來隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，本病的發(fā)生呈暴發(fā)趨勢，對養(yǎng)豬業(yè)的危害日益嚴重。
　　本病病原為胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）。其毒力因子為主要的免疫原。App有很多毒力因子可以引起豬致病，包括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白（Outer memberanc protein，Omp）、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶、滲透因子及溶血素等[2]。有人對上述毒力因子及其免疫原性進行分析，發(fā)現(xiàn)溶血毒素、外膜蛋白在胸膜肺炎發(fā)生過程中扮演著更為重要的角色，也是主要的免疫原性物質(zhì)[3-6]。
　　在App的15個血清型中共發(fā)現(xiàn)了4種不同的Apx溶血素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。Apx Ⅰ具有很強的溶血活性，它對肺泡巨噬細胞和中性粒細胞也具有很強的細胞毒性作用。而ApxⅢ與ApxⅠ和ApxⅡ的差異較大[4]，它對熱穩(wěn)定，具有很強的細胞毒性，但卻沒有溶血活性。研究表明，ApxⅢ對豬肺泡巨噬細胞和中性粒細胞有很強的殺傷力，可嚴重破壞豬肺部非特異性細胞防御體系。它們都是胸膜肺炎放線桿菌的毒力因子，也是重要的保護性抗原[5]。Omp是胸膜肺炎放線桿菌的另一個重要毒力因子，針對Omp的抗體具有調(diào)理活性，所以O(shè)mp也是App的一種重要保護性抗原[6]。由此對毒素pET- ApxⅠA、pET-ApxⅢA、pPRoAppOML-1進行了表達及重組蛋白的純化。
　　1　材料與方法
　　1.1　菌株及質(zhì)粒
　　重組表達質(zhì)粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1由本實驗室構(gòu)建并保存。
　　1.2　主要試劑
　　異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、鹽酸胍（guanidine hydrochloride）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇（PEG1500）、二硫蘇糖醇（DTT）、甘氨酸（Glycine）、尿素等購自BBI公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自Promega公司；丙烯酰胺溶液（29∶1）儲存液、Trion-X 100、Tween-20、過硫酸銨（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、硝酸纖維素膜（NC膜）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、月桂肌氨酸、20×PBS濃縮液、氨基黑等購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；豬傳染性胸膜肺炎陽性血清由本實驗室制備；辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG（HRP-IgG）購自Gibco公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、牛血清白蛋白（BSA）、氯化鈷購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
　　1.3　重組菌的誘導(dǎo)表達
　　將本實驗室保存的重組質(zhì)粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109（DE3），然后將其涂布于含有卡那霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h后可挑取單菌落劃線培養(yǎng)，再接入5 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃以220 r/min搖菌培養(yǎng)6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)約8 h。
　　同時將本實驗室保存的pPRoAppOml-1轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109（DE3），然后將其涂布于含有氨卞霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h后可挑取單菌落劃線培養(yǎng)，再接入5 mL LB培養(yǎng)基中，于37 ℃以220 r/min搖菌培養(yǎng)6 h～8 h后，用0.5 mmol/L～1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)約8 h。
　　1.4　表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定
　　按照分子克隆書中所介紹的方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以鑒定表達產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量和表達量，同時用僅轉(zhuǎn)入空載體的全菌菌體蛋白液作為陰性對照。
　　1.5　重組蛋白的提純及復(fù)性
　　1.5.1　包涵體的純化
　　將誘導(dǎo)表達的重組菌收集、離心、洗滌后，重懸于PBS中進行超聲破碎，從細胞裂解物中提取包涵體，裂解包涵體并進行重組蛋白的純化和復(fù)性。
　　1.5.1.1　包涵體的提取和初純
　　①收集誘導(dǎo)表達的重組菌全菌液，于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清；②分別用去離子水和冰冷的1×PBS（pH 7.4）洗滌菌體沉淀各一次，每次于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清；③按5 mL PBS/100 mL原菌液量重懸菌體沉淀，4 ℃作用30 min后置于冰上進行超聲波破碎（250 W，脈沖5 s，間隔5 s，作用溫度4 ℃，處理10 min～15 min。處理應(yīng)以不產(chǎn)生泡沫、尖銳刺耳聲和菌液成半透明為度），置－20 ℃凍存數(shù)小時，再次進行超聲波破碎（同上述條件）；④超聲破碎2次后，于4 ℃以7 500 r/min離心10 min，棄上清，所得沉淀即為包涵體；⑤用細胞裂解液Ⅱ洗滌所得包涵體2次～3次，去離子水洗滌1次～2次，置于－20 ℃?zhèn)溆谩?br /> 　　1.5.1.2　包涵體的純化　由于包涵體的純化使用鎳柱親和層析（柱料為Ni-NTA His·Bind Resins），所以選用了pET-28a表達載體，以便在鎳柱純化時利用組氨酸標(biāo)簽的作用純化出所需要的蛋白。采用鎳親和層析試劑盒變性條件下的純化包涵體方法，按照試劑盒說明書的步驟和方法進行柱料的再生。
　　1.5.1.3　包涵體純化物的復(fù)性　按蛋白復(fù)性試劑盒說明書操作，進行復(fù)性。
　　1.6　表達產(chǎn)物的Western blot分析
　　以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量為參照，進行標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量、pET-APXⅠA、pET-APXⅢA、pPRocAppOml-1表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后進行Western blot分析。
　　2　結(jié)果
　　2.1　重組蛋白的鑒定
　　2.1.1　SDS-PAGE鑒定　重組表達菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后分別產(chǎn)生約41、41、45ku大小的表達條帶，與預(yù)期蛋白大小基本相符，而pET-28a空載體轉(zhuǎn)化對照菌的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物無此表達帶，初步表明重組表達菌表達產(chǎn)物為目的重組蛋白（圖1，圖2）。
　　2.1.2　包涵體純化物的鑒定
　　結(jié)果見圖3。
　　1.IPTG誘導(dǎo)的pET-28a產(chǎn)物；2～6. IPTG誘導(dǎo)的分別在2、4、6、8、10 h pET- ApxⅠA的產(chǎn)物；7～11.IPTG誘導(dǎo)的分別在2、4、6、8、10 h pPRoAppOml-1的產(chǎn)物；M1，M2.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
　　1.pET-28a products induced with IPTG；2-6.pET-ApxⅠA products inducedin 2,4,6,8,10 h with IPTG；7-11.pPRoAppOml-1 products induced in 2,4,6,8,10 hwith IPTG；M1，M2.Protein Marker
　　圖1　pET- ApxⅠA和PPRoAppOml-1重組菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE
　　Fig.1　SDS-PAGE of expression products ofpET-ApxⅠand pPRoAppOml-1
　　1.IPTG誘導(dǎo)的pET28a產(chǎn)物；2～5. IPTG誘導(dǎo)的pET-ApxⅢA分別在2、4、6、8、10 h的產(chǎn)物；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
　　1.pET-28a products induced with IPTG；2-5.pET-ApxⅠA products induced in 2,4,6,8,10 h with IPTG；M.Protein Marker
　　圖2　pET- ApxⅢA重組菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE
　　Fig 2　SDS-PAGE of expression products of pET- ApxⅢA
　　1、4、6.分別為IPTG誘導(dǎo)的pET-APXⅠA、pPRoAppOml-1、pET-APXⅢA產(chǎn)物；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2、5、7.分別為pET-APXⅠA、pPRoAppOml-1、pET-APXⅢA純化后產(chǎn)物
　　1,4,6.pET-APXⅠA，pPRoAppOml-1 and pET-APXⅢA products induced with IPTG；M.Protein Marker；2,5,7.Purified pET-APXⅠA，pPRoAppOML-1 and pET-APXⅢA expression products
　　圖3　純化的重組菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE
　　Fig.3　SDS-PAGE of purified expression products of therecombinant bacteria
　　從圖3可以看出，在純化之后，雜帶明顯減少，包涵體的純度得到了顯著的提高。
　　2.1.3　Western blot分析　結(jié)果顯示（圖4），重組菌表達產(chǎn)物中的蛋白條帶可被豬傳染性胸膜肺炎陽性血清識別。證明已獲得重組蛋白的準(zhǔn)確表達。
　　M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.分別為IPTG誘導(dǎo)的pET- ApxⅠA、pPRoAppOml-1、pET- APXⅢA產(chǎn)物
　　M. Protein Maker；1-3.pET-APXⅠA，pPRoAppOml-1 and pET- APXⅢA expressionproducts with IPTG
　　圖4　表達產(chǎn)物的Western blot分析
　　Fig.4　Western blot analysis of the expression products
　　3　討論
　　3.1　App是一種多毒力因子的條件致病菌，其致病因子及其致病機理非常復(fù)雜。我們對其相關(guān)毒素基因構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行了表達，對其表達條件進行了摸索，經(jīng)過試驗對誘導(dǎo)劑的濃度和表達溫度進行了選擇，最終確定了最佳的表達條件，
　　IPTG誘導(dǎo)最適終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)最適溫度選擇為37 ℃，誘導(dǎo)時間最佳為8 h。這為以后的純化作了很好的鋪墊，是蛋白純化得以順利進行。
　　3.2　本試驗所表達的產(chǎn)物為包涵體形式，包涵體是蛋白質(zhì)聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎。收集到的包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2 mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白[7]，這一步很重要，否則會導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解。所以試驗采用的是反復(fù)凍融細胞并結(jié)合超聲波處理來裂解細胞，由于超聲處理過程容易產(chǎn)生熱量集中，造成蛋白碳化，選擇在冰上超聲，并采用一定的時間間隔，延長超聲處理時間使包涵體蛋白徹底釋放，沉淀下來，與可溶性蛋白分離，從而獲得包涵體。經(jīng)過純化，得到比較理想的產(chǎn)物條帶，但是，其量比較小，所以在以后的工作中還需要進一步的摸索條件。
　　3.3　純化產(chǎn)物經(jīng)過Western blot分析均有較好的免疫反應(yīng)性，這些工作和結(jié)果為進一步研究新型亞單位疫苗和診斷試劑奠定了良好的基礎(chǔ)。