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標(biāo)題: 飼料用木聚糖酶活力測(cè)定的研究 [打印本頁(yè)]

作者: kiroco 時(shí)間: 2014-2-17 12:43
標(biāo)題: 飼料用木聚糖酶活力測(cè)定的研究
飼料用木聚糖酶的分析測(cè)定是長(zhǎng)期以來(lái)困擾木聚糖酶生產(chǎn)和應(yīng)用的一個(gè)主要難題,特別是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的木聚糖酶,發(fā)酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纖維素酶、葡聚糖酶、果膠酶和甘露聚糖酶等)[1-3]。文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于影響酶活測(cè)定的因素很多,測(cè)定的重復(fù)性較差 [4-5，7]，除了溫度和pH值以外,還存在著其它很多不確定的因素。本文將從底物的性質(zhì)和濃度、酶樣的稀釋度、離子強(qiáng)度和反應(yīng)時(shí)間等方面討論對(duì)酶活測(cè)定的影響,提出比較可行的飼料用木聚糖酶的分析方法。

酶活定義為在37 ℃和設(shè)定pH值條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中降解釋放1 μmol/l還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。測(cè)定木聚糖酶活力的方法主要有3種：粘度法、底物染色法和還原糖法。

粘度法是通過(guò)測(cè)定木聚糖酶對(duì)底物粘度的降解速度來(lái)計(jì)算酶活力，這種測(cè)定分析方法有較好的實(shí)用價(jià)值，但是測(cè)定過(guò)程比較繁瑣，而且重復(fù)性較差，目前很少采用。

底物染色法是一種比較簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法,其基本原理是以木聚糖為基質(zhì),用膠聯(lián)方式連接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡,質(zhì)量穩(wěn)定的片劑。這種片劑容易溶于水溶液中,與木聚糖酶反應(yīng)后,長(zhǎng)鏈的木聚糖被降解,結(jié)合的染料分子被釋放到溶液中。通過(guò)測(cè)定溶液中染料的濃度,就可以就算出酶活力。這種測(cè)定方法經(jīng)常被一些專業(yè)生產(chǎn)生物酶的大型企業(yè)采用。但是它只能測(cè)定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。

還原糖法是通過(guò)測(cè)定還原糖的產(chǎn)量來(lái)計(jì)算酶活力。這種分析方法也比較簡(jiǎn)便，而且重復(fù)性也比較好。國(guó)內(nèi)外關(guān)于木聚糖酶的研究報(bào)告多數(shù)采用這種方法。這種方法的主要不足是不能很好地分析內(nèi)切酶的活力，而內(nèi)切酶的活力對(duì)于飼料酶的實(shí)際使用效果來(lái)說(shuō)是很重要的。

如果希望通過(guò)測(cè)定木聚糖酶在某一標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的活力來(lái)判斷木聚糖酶質(zhì)量的優(yōu)劣或者預(yù)測(cè)其動(dòng)物飼喂效果是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。木聚糖酶的實(shí)際作用底物是不溶于水的高聚物，它們主要存在于植物種子的表皮層內(nèi)，與葡聚糖、果膠、甘露聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合在一起。在天然木聚糖與水組成的多相體系中，酶總是處于底物不飽和狀態(tài)，因此難以用測(cè)定酶反應(yīng)初速度的方法測(cè)定酶活力。酶與底物的反應(yīng)是在固相界面上進(jìn)行的，其酶解反應(yīng)速率受到底物對(duì)酶蛋白吸附速率和產(chǎn)物擴(kuò)散速率的限制[4]。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖，如燕麥木聚糖和樺木木聚糖，其測(cè)定值要比實(shí)際發(fā)揮作用的酶活力高出很多倍[5-6]。從目前的研究進(jìn)展分析，制定一個(gè)絕對(duì)公平的標(biāo)準(zhǔn)是很困難的，幾乎是不可能的。

2005年6月，我們接受全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)下達(dá)的木聚糖酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)，聯(lián)合了眾多酶制劑企業(yè)共同起草了木聚糖酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)起草過(guò)程中，我們分析了近300 個(gè)含有木聚糖酶的樣品，測(cè)定數(shù)據(jù)約1 200個(gè)。通過(guò)綜合各種因素，采用還原糖法，分析了影響酶活力測(cè)定值的因素，同時(shí)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，制定了相對(duì)比較公正科學(xué)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

1 重要操作分析參數(shù)的確定

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

確定酶解產(chǎn)物濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是酶活力測(cè)定的前提，試驗(yàn)采用DNS法測(cè)定木糖濃度，其線性范圍為：木糖濃度在0.2～0.7 mg/ml之間，吸光度在0.15～0.70之間

1.2 底物的性質(zhì)

從酶的組成分析可以發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶存在著底物作用的特異性。

目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的木聚糖酶主要有兩大類，一類是用于飼料，另外一類是用于造紙。用于飼料的木聚糖酶應(yīng)該以降解燕麥木聚糖的能力為主要檢測(cè)指標(biāo)，而用于造紙工業(yè)的木聚糖酶應(yīng)該以降解樺木木聚糖為主要分析指標(biāo)。

在實(shí)際使用過(guò)程中，單純比較某一種酶活力指標(biāo)是不夠的，但是要想全面衡量飼用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困難的。目前國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道通常以降解燕麥木聚糖(Sigma X0627)的活力作為主要比較指標(biāo)[8-10]，這是因?yàn)闇y(cè)定降解燕麥木聚糖相對(duì)比較容易，重復(fù)性也比較好。因此筆者建議測(cè)定飼料用木聚糖酶活力的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也以測(cè)定降解燕麥木聚糖的活力為主要指標(biāo)。

從理論上分析，只要滿足3個(gè)條件，即能被酶作用、很好的代表性、很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，都可以作為測(cè)定飼料酶活力的底物。但是，從目前的研究分析發(fā)現(xiàn)，能符合這個(gè)條件的底物只有Sigma X0627，雖然Sigma X0627這個(gè)產(chǎn)品的本意并不是想用于木聚糖酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)底物。無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，也不論是生產(chǎn)實(shí)際還是SCI論文，涉及木聚糖酶活力測(cè)定的底物基本上都是用Sigma X0627。

1.3 底物濃度對(duì)測(cè)定活力的影響

底物濃度對(duì)測(cè)定值有重要影響，這主要與酶反應(yīng)的米氏常數(shù)Km值有關(guān)。圖2是關(guān)于3種菌種產(chǎn)生的木聚糖酶，它們要求的飽和底物作用濃度(使酶活發(fā)揮達(dá)到99%的飽和活力時(shí)的底物濃度)有一定差異。

從理論上分析，底物濃度越高分析的偏差越小。但是，實(shí)際上并非如此，過(guò)高的底物濃度也會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不利的影響。燕麥木聚糖比較難溶于水，需要先在堿性條件下加熱，然后才能溶解。如果配制濃度過(guò)高，底物溶液中的還原糖和低聚糖含量都增大，使測(cè)定本底值升高，所以過(guò)高的木聚糖濃度是不必要的。由圖2可知，三種木聚糖酶(Xylanase 1、Xylanase 2、Xylanase 3分別來(lái)源于硫色曲霉A. sulphureus、米曲霉A. orzyae和黑曲霉A. niger)，它們的飽和底物濃度都不超過(guò)3.0 mg/ml。

目前市場(chǎng)上流行的由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶，其結(jié)構(gòu)基因也是來(lái)自曲霉菌或者細(xì)菌，而細(xì)菌產(chǎn)生的木聚糖酶(包括其它酶種)其飽和底物濃度遠(yuǎn)低于曲霉菌產(chǎn)生的酶。

燕麥木聚糖(Sigma X0627)在中性條件下很難溶解，在堿性條件下容易溶解。在溶解燕麥木聚糖底物時(shí)可以先在氫氧化鈉堿性溶液中溶解，然后再用醋酸溶液調(diào)節(jié)到所需的酸堿度。事實(shí)證明，這種方式是比較好的，所產(chǎn)生的本底還原糖濃度也是很低的，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很小。

1.4 反應(yīng)液離子強(qiáng)度對(duì)測(cè)定的影響

反應(yīng)液的離子強(qiáng)度對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果也有影響。如圖3所示：在不同離子強(qiáng)度條件下測(cè)定纖維素酶的活力，結(jié)果有較大差異。溶液的離子強(qiáng)度影響酶分子的空間構(gòu)像，從而影響了酶分子活力的發(fā)揮。所以，在測(cè)定過(guò)程中應(yīng)該統(tǒng)一反應(yīng)液的離子強(qiáng)度，這一點(diǎn)往往被人們忽視。那么究竟應(yīng)該選擇何種離子強(qiáng)度比較合適，目前還沒(méi)有統(tǒng)一。不同的酶系要求的最佳離子強(qiáng)度各不相同，需要經(jīng)過(guò)探索才能確定。根據(jù)畜禽消化道的生理狀況，筆者建議反應(yīng)液的離子強(qiáng)度采用0.1 mol/l。

1.5 反應(yīng)時(shí)間的選擇

為了使獲得的測(cè)定值盡可能準(zhǔn)確，不僅需要選擇在線性的反應(yīng)范圍內(nèi)，而且應(yīng)該有足夠的線性反應(yīng)時(shí)間。在線性反應(yīng)條件下，延續(xù)的作用時(shí)間越長(zhǎng)，測(cè)定的相對(duì)誤差也越小。

大量研究發(fā)現(xiàn),不同的酶系其線性作用時(shí)間各不相同。一般情況下,酶系較全的組分線性作用時(shí)間較長(zhǎng)。而酶系比較簡(jiǎn)單的組分,線性作用時(shí)間較短。圖4是2種比較典型的木聚糖酶系及比利時(shí)生產(chǎn)酶C 的線性范圍。硫色曲霉(A. sulphureus MAFIC-001)產(chǎn)生的木聚糖酶A的線性作用時(shí)間接近100 min，黑曲霉(A. niger MAFIC-005)產(chǎn)生的木聚糖酶B的線性作用時(shí)間不到60 min。從文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)和筆者的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比利時(shí)生產(chǎn)的一種由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶C的線性作用時(shí)間最長(zhǎng)，可達(dá)8 h左右。線性反應(yīng)時(shí)間最短的商業(yè)木聚糖酶是由一種木霉發(fā)酵產(chǎn)生的，線性反應(yīng)時(shí)間不到20 min[5]。

酶反應(yīng)的線性作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)分析產(chǎn)物本底值含量高的酶產(chǎn)品是很有利用價(jià)值的。在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中，為了消除產(chǎn)品的產(chǎn)物本底誤差，必須適當(dāng)加大稀釋度。此時(shí)就要盡量延長(zhǎng)酶反應(yīng)時(shí)間，使形成的產(chǎn)物量盡可能與本底值拉開(kāi)距離。這種情況特別適用于測(cè)定活力比較低的酶產(chǎn)品。

1.6 酶反應(yīng)液pH值的選擇

反應(yīng)液pH值的選擇是重要參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn),目前木聚糖酶的同功酶至少有200種,有商業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的不少于10種。它們的最適pH值都不一樣,而且有些變動(dòng)幅度還很大(見(jiàn)圖5)。

如何確定合理的分析用pH值對(duì)酶活力測(cè)定的影響。目前國(guó)內(nèi)的很多飼料生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于飼料酶的綜合評(píng)價(jià)能力很低，很多用戶只看標(biāo)示酶活力，沒(méi)有考慮實(shí)際作用效果。由于飼料酶產(chǎn)品標(biāo)簽上不能標(biāo)示很寬泛的pH值范圍內(nèi)的表現(xiàn)酶活，另外，也由于生產(chǎn)菌種不同，即使是同樣的測(cè)定酶活力，實(shí)際使用效果也是不同的。

所以必須要定一個(gè)比較合理的pH值，在這個(gè)pH值條件下測(cè)定酶活力。酶活力只是一個(gè)酶活效果的參考值，但是對(duì)于產(chǎn)品本身來(lái)說(shuō)確是判定產(chǎn)品質(zhì)量是否合格的重要指標(biāo)。

考慮到目前流行的測(cè)定木聚糖酶pH值和實(shí)際可操作性，本標(biāo)準(zhǔn)采用 5.50作為測(cè)定用pH值。

1.7 樣品酶活力檢測(cè)限量的確定

如果從純粹的分析儀器和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍考慮，樣品酶活力的檢測(cè)限量可以達(dá)到1.0 U/g，甚至更低。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一些在預(yù)混料中的飼料酶，有些木聚糖酶活力在5.0 U/g以上，也很難測(cè)定出來(lái)，往往只顯示0.2～0.5 U/g。使用螯合物以消除金屬離子的干擾，結(jié)果也不理想。這種現(xiàn)象不僅存在于木聚糖酶，其它一些飼料酶，如常用的植酸酶、纖維素酶和葡聚糖酶等都有類似現(xiàn)象。

考慮到飼料用木聚糖酶的實(shí)際情況，我們選定10.0 U/g作為其檢測(cè)限量。事實(shí)上，目前流通的絕大多數(shù)飼料用木聚糖酶(包括含木聚糖酶的復(fù)合酶)的活力很少低于20.0 U/g，選用10.0 U/g作為檢測(cè)限量已經(jīng)覆蓋了99%以上的流通產(chǎn)品。

1.8 酶樣的稀釋度對(duì)酶活力測(cè)定的影響(見(jiàn)表2)

酶分子的濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果也有重要影響，表2是關(guān)于硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵制品中的木聚糖酶活力測(cè)定值(Sigma X0627為底物)與稀釋倍數(shù)的關(guān)系。

確定酶樣的稀釋度實(shí)質(zhì)上是選擇酶分子的數(shù)量與底物分子的數(shù)量之間的比例，二者的比例只有在一定的范圍內(nèi)，酶分子的活力才能得到充分發(fā)揮。超出了這個(gè)比例范圍，酶的活力發(fā)揮受到影響。所以在測(cè)定酶活力時(shí)需要做酶樣的稀釋梯度，梯度的間隔不能太大，最好是加倍稀釋，以確定合適的線性測(cè)量范圍。

1.9 底物存放時(shí)間對(duì)酶活力測(cè)定值的影響

木聚糖酶的反應(yīng)底物(燕麥木聚糖Sigma X0627)是多聚物，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)使底物分解，產(chǎn)生較多的小分子寡聚物和單體，使測(cè)定值偏高，同時(shí)還會(huì)造成較高的本底值，影響測(cè)定精度。我們通過(guò)試驗(yàn)分析了10.0 mg/ml的木聚糖底物溶液在4 ℃條件下的存放時(shí)間對(duì)本底還原糖濃度的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

木聚糖是比較容易降解的多糖。在4 ℃冰箱存放2 d，降解產(chǎn)生的還原糖達(dá)到0.142 mg/ml，這個(gè)本底值對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果有很大影響。建議底物配制后的存放時(shí)間不超過(guò)12 h，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.10 關(guān)于樣品處理的一些細(xì)節(jié)問(wèn)題

目前在測(cè)定分析中主要存在的操作細(xì)節(jié)問(wèn)題有：樣品在緩沖液中合適的存放時(shí)間和酶液如果采用過(guò)濾獲得清液是否可行。

根據(jù)我們的研究，一般情況下，樣品中的酶蛋白在磁力攪拌30 min的條件下已經(jīng)充分溶解到緩沖液中了，沒(méi)必要再進(jìn)一步存放浸泡。但是如果遇到一些包裹很致密的顆粒，需要一定時(shí)間的浸泡才能使酶蛋白充分釋放。考慮到生產(chǎn)企業(yè)的實(shí)際可操作性和分析結(jié)果的可靠性，我們建議在冰箱中再存放1～2 h。從目前我們獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，浸泡2 h已經(jīng)足夠，目前還沒(méi)有遇到例外。

樣品酶液都采用低速離心(3 000 g以下)獲得清液，如果采用過(guò)濾，酶蛋白容易被過(guò)濾介質(zhì)吸附，從而造成酶活力損失。酶蛋白的分子量越大，截流損失越多。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，纖維素酶的截留損失在 10%~15%，木聚糖酶的活力損失小一些，不超過(guò)10%，考慮到離心比較方便，不會(huì)對(duì)生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)多大設(shè)備投資，所以，建議采用低速離心獲得上清酶液。

1.11 驗(yàn)證對(duì)比

對(duì)于飼料用木聚糖酶活力的分析測(cè)定，筆者建議以Sigma X0627為標(biāo)準(zhǔn)底物，反應(yīng)液中底物的濃度為5 mg/ml，配制的木聚糖底物溶液的存放時(shí)間不超過(guò)12 h(4 ℃存放)，反應(yīng)體系的pH值為5.5，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)體系的緩沖液(HAc-NaAc體系)鹽濃度為0.1 mol/l，反應(yīng)時(shí)間為30 min。

以上述方法為基準(zhǔn)，試驗(yàn)測(cè)定分析了近300 個(gè)含有木聚糖酶的樣品，現(xiàn)列舉12個(gè)比較有代表性分析結(jié)果(見(jiàn)表4，保留4位有效數(shù)字)，相對(duì)誤差均不超過(guò)6.0%。

2 結(jié)論

綜合上述分析結(jié)果，除了pH值和溫度以外，底物的性質(zhì)和濃度、酶分子濃度、反應(yīng)時(shí)間、溶液的離子強(qiáng)度和體系的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都能影響酶的測(cè)定活力。由于這些影響因素的存在，使得酶活力的測(cè)定分析變得紛繁復(fù)雜，同一種酶在不同的條件下分析獲得的結(jié)果存在很大偏差。

為了測(cè)定的統(tǒng)一，同時(shí)使結(jié)果有較好的可比性，建議固定反應(yīng)體系(即固定反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度和要求的產(chǎn)物濃度范圍)。樣品酶做不同的稀釋度，只有在規(guī)定條件下產(chǎn)生所要求的產(chǎn)物濃度范圍的稀釋酶液才是有效的作用酶液，然后，以此為依據(jù)計(jì)算酶活力。這種方法雖然比較繁瑣，但是它排除了許多干擾，有較好的可比性。

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陸文清，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心，副研究員，100193，北京海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)。

何麗花、曹云鶴，單位及通訊地址同第一作者。

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