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標(biāo)題: 幾種常見(jiàn)飼用酶制劑的酶活測(cè)定與分析 [打印本頁(yè)]
作者: yuren925    時(shí)間: 2007-11-12 09:13
標(biāo)題: 幾種常見(jiàn)飼用酶制劑的酶活測(cè)定與分析
幾種常見(jiàn)飼用酶制劑的酶活測(cè)定與分析
1．酸性蛋白酶的測(cè)定  2。纖維素酶的活力測(cè)定 3。植物酶活力測(cè)定 4。討論
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，酶制劑的生產(chǎn)成本日漸下降，越來(lái)越多的酶制劑被應(yīng)用在飼料工業(yè)中，它們?cè)谔岣唢暳系臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值，減少糞便排放，改善生態(tài)環(huán)境和抵抗疾病等方面均發(fā)揮了積極作用。但由于酶活的測(cè)定比較繁瑣，酶活的定義、測(cè)定方法和測(cè)定條件不統(tǒng)一，可比性差，給廣大用戶(hù)在選購(gòu)和使用時(shí)造成了諸多不便。而且在通常情況下飼用酶的作用效果往往需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間（至少15d）后才能得到顯示。許多不法分子利用這些因素，采用蒙騙手段銷(xiāo)售低劣飼用酶，用戶(hù)不經(jīng)測(cè)定而直接使用就難免會(huì)上當(dāng)受騙，造成經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)飼用酶制劑的生產(chǎn)廠很多，而真正高質(zhì)量的飼用酶并不多，使得許多用戶(hù)，尤其是養(yǎng)殖戶(hù)，對(duì)酶制劑的使用效果產(chǎn)生懷疑，從至拒絕使用。為了扶正驅(qū)邪，本文將針對(duì)幾種常用的飼用酶制劑進(jìn)行討論，簡(jiǎn)要介紹它們的一些簡(jiǎn)便的分析測(cè)定方法，供飼料生產(chǎn)廠和廣大養(yǎng)殖戶(hù)參考。 1.酸性蛋白酶活力的測(cè)定
1．1原理
福林試劑在堿性條件下可被酚類(lèi)化合物還原呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），它使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)，利用這個(gè)原理可以測(cè)定蛋白酶活力的強(qiáng)弱。以酪蛋白為作用底物，在一定pH值和溫度下，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一段時(shí)間后加入三氯乙酸，終止酶的反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開(kāi)。經(jīng)過(guò)濾后取過(guò)濾液（含蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的三氯乙酸溶液），用Na2C03堿化，再加入福林試劑使之發(fā)色。藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱與過(guò)濾波中蛋白水解產(chǎn)物的量成正比例，而水解產(chǎn)物的量又同酶活力成正比。因此，根據(jù)藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱可以計(jì)算出蛋白酶的活力。
1．2操作方法

1．2．1 試劑
1．2．1．l福林試劑
于2000ml磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉（Na2WO4•2H2O）100g，鉬酸鈉（NaMoO4•2H2O）25g。水700ml，85％的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10h，加入硫酸鋰（Li2SO4）150g，蒸餾水50ml，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再蒸沸15min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色。若溶液有綠色，需再加數(shù)滴液溴，再蒸沸除去，冷卻后定容至1000ml，過(guò)濾，置于棕色瓶中保存，此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋。
1．2．1．2 0.4mol／l的TCA溶液
稱(chēng)取三氯乙酸65.4g，加水定容至1000ml。
1．2．1．3 0.8mol／l的碳酸鈉溶液
稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉84.8g，加水溶解，定容至1000ml。
1．2．1．4 pH值為3.6的醋酸緩沖液
稱(chēng)取NaAc•3H20 16g與268ml濃度為6mol／l的醋酸溶液混合，稀釋定容至1000ml。
1．2．1．5 2％酪蛋白溶液
稱(chēng)取干酪索20g，加入0.lmol／l的氫氧化鈉20ml，在水浴中加熱溶解，然后用pH值為3.6的醋酸緩沖液定容至1000ml。該試劑配制后應(yīng)及時(shí)使用，或放入冰箱內(nèi)保存。
1．2．1．6 100μg／ml酪氨酸溶液
精確稱(chēng)取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.lmol／l的鹽酸，使之溶解，加蒸餾水定容至1000ml。該試劑配制后也應(yīng)及時(shí)使用，或放入冰箱內(nèi)保存。
1．2．2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
配制濃度分別為（單位：μg／ml）：0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液，各取lml（做4個(gè)平行樣），加入不同的試管中，再各加入已稀釋的福林試劑lml和0.4mol／l的碳酸鈉5ml，搖勻，置于水浴鍋中，40℃保溫發(fā)色20min。然后在721型分光光度計(jì)上進(jìn)行比色測(cè)定（波長(zhǎng)660nm，以濃度為0μg／ml的酪氨酸反應(yīng)液做空白對(duì)照）。

1．2．3 樣品酶活的測(cè)定
稱(chēng)取酶粉5g，充分碾細(xì)，加蒸餾水1000ml，在 4O℃水中攪拌3Omin，充分溶出酶蛋白，然后過(guò)濾，濾液用0.1mol／lpH值為3.6的醋酸緩沖液稀釋到一定倍數(shù)。取稀釋液1ml（做平行樣4個(gè)），40℃水浴預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1ml，精確保溫10min。然后立即加入 0.4mol／l三氯醋酸2ml，終止反應(yīng)。繼續(xù)置水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀，然后離心分離或過(guò)濾。取濾液lml，再加入0.8mol／l碳酸鈉溶液5ml和已稀釋的福林試劑1ml，搖勻保溫發(fā)色20min后，進(jìn)行比色測(cè)定。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算酪氨酸的釋放量。
l．2．4 酶活計(jì)算
蛋白酶活力＝A×4×N／10
式中：A——對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出的酪氨酸釋放量；
4－－4ml反應(yīng)液取出1ml；
N－－酶粉的稀釋倍數(shù)；
10——反應(yīng)時(shí)間10min。
酸性蛋白酶酶活定義：在40℃，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位，

2 纖維素酶活力的測(cè)定

2．l 原理
纖維素酶是水解纖維素生產(chǎn)葡萄糖及纖維二糖的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。包括C1酶、CX酶及纖維二糖酶。C1酶使天然纖維素晶體分鏈，成為直鏈纖維素。CX酶不能水解天然纖維素，但能分解直鏈纖維素β-1，4糖苷鍵生成纖維二糖。纖維二糖經(jīng)過(guò)纖維二糖酶作用生成葡萄糖。測(cè)定葡萄糖的方法很多，比較簡(jiǎn)單的方法可以采用3，5-二硝基水楊酸法（簡(jiǎn)稱(chēng)DNS法）。3，5-H硝基水楊酸是一種氧化劑，能與還原糖作用，使硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬?。在一定的還原糖濃度范圍內(nèi)，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，據(jù)此可以推算出纖維素酶的活力。但是不同來(lái)源的纖維素酶對(duì)不同的天然纖維素的分解能力也不同，即使是同一種酶，對(duì)不同的天然纖維素的分解能力也不同。為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常以羧甲基纖維素鈉鹽（簡(jiǎn)稱(chēng)CMC）作為纖維素酶作用的底物。但需要指出的是CMC無(wú)論在結(jié)構(gòu)上還是在性質(zhì)上都不同于天然纖維素，天然纖維素不溶于水，而CMC有很強(qiáng)的親水性，非常容易被纖維素酶分解。在相同條件下，同一種纖維素酶分解CMC所產(chǎn)生的還原糖遠(yuǎn)大于水解天然纖維素所產(chǎn)生的還原糖。因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的數(shù)值總是比較高的，只能供作參考。
2．2 操作方法
2．2．1 試劑
2．2．1．l 二硝基水楊酸試劑
稱(chēng)取酒石酸鉀鈉91g，溶于500ml水中，再依次加入3，5-二硝基水楊酸3．5g，NaOH2Og，加熱攪拌、溶解，再加入重蒸酚2.5g，無(wú)水亞硫酸鈉2.5g，加熱攪拌、溶解，冷卻后定容至 1000ml。儲(chǔ)棕色瓶中，放置一周后使用。
2．2．1．2 pH值為4.6的檸檬酸緩沖濃濃度為0.1mol／l的檸檬酸溶液26．7ml和濃度為0.2mol／l的磷酸氫二鈉溶液23．3ml，混合后加水稀釋到1000ml。
2．2．1．3 pH值為5.0的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液取濃度為0.2mol／l的磷酸氫二納溶液25．7ml和濃度為0.1mol／l檸檬酸溶液24.3m1，混合后加水稀釋至 1000ml。
2．2．1．4 羧甲基纖維素鈉鹽溶液稱(chēng)取CMC 1g，加水1000ml，在水浴中加熱溶解，再加入20mlpH值為5.0的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液和 40ml水，混勻。
2．2．1．5 500μg／ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稱(chēng)取分析純葡萄糖0.5g（在105℃干燥至恒重），加蒸餾水溶解，定容至 1O00ml。
2．2．2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制濃度（單位：μg／ml）分別為：O、40、80、100、160、200、240的葡萄糖溶液。各取5ml加入到不同的試管中，再分別加入DNS試劑5ml，加熱煮沸5min，取出置冷水中冷卻，在721型分光光度計(jì)上比色。（波長(zhǎng)為520nm，以濃度為0μg／ml的葡萄糖反應(yīng)液體作空白對(duì)照）。
2．2．3 樣品酶活的測(cè)定取纖維素酶粉5g，充分碾細(xì)，加100ml蒸餾水，與40℃水浴中，攪拌3Omin，使酶蛋白充分溶出，過(guò)濾，離心取上清液，稀釋至恰當(dāng)倍數(shù)。吸取稀釋的酶液lml，加入 CMC溶液4ml，混勻，在40℃保溫糖化30min，取出后加入NS試劑5ml，（空白樣：5ml蒸餾水十 5mlDNS試劑）蒸煮 5min，取出冷卻后進(jìn)行比色測(cè)定，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算葡萄糖的含量。
2．2．4 酶活計(jì)算CMC酶活＝（G × N）／（ V × t）式中：G――酶分解CMC釋放出的葡萄糖量，μg；N――酶粉的稀釋倍數(shù)；V一－反應(yīng)用酶量，g；t——反Jdl時(shí)間，min。纖維素酶活定義：在pH值為5.0，40℃條件下每分鐘水解 CMC釋放出1μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。
3 植酸酶活力的測(cè)定

3．1原理
植酸酶能夠分解值酸，釋放出無(wú)機(jī)磷。選用植酸鈉為酶的作用底物，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的釋放量可以計(jì)算酶活。目前植酸酶酶活的測(cè)定方法主要有4種，其中釩鉬磷法具有較高的權(quán)威性。該方法是Gist－Brocades和BASF公司在1991年提出的，其原理是利用植酸酶水解植酸鹽釋放無(wú)機(jī)磷，通過(guò)加入酸性鉬一釩試劑，使水解反應(yīng)停止，同時(shí)與水解釋放出來(lái)的無(wú)機(jī)磷產(chǎn)生顏色反應(yīng)，形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物，在415nm波長(zhǎng)下測(cè)定磷的含量。以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（或標(biāo)準(zhǔn)植酸酶）為參照，計(jì)算酶活。該方法于1994年列入AOAC，我國(guó)已將此法的測(cè)定結(jié)果作為審批商品植酸酶注冊(cè)許可證和驗(yàn)收產(chǎn)品的法定商檢依據(jù)。
3．2 操作方法
3．2．1 試劑
3．2．1．1 稀硝酸溶液量取100ml濃度為65％的濃硝酸，200ml蒸餾水混合。
3．2．1．2 鉬酸銨試劑稱(chēng)取100g鉑酸鐵，溶解在800ml蒸餾水中，再加入10ml 25％的氨水，定容至 1000ml，儲(chǔ)介在暗處，保存期8周。
3．2．1．3 釩酸銨試劑稱(chēng)取2.35g釩酸銨NH4VO3。，溶解在 400ml水中，預(yù)熱至55℃，加人20ml稀硝酸，定容至1000ml儲(chǔ)存在暗處，保存期8周。
3．2．1．4 釩鉬終止液取鉬酸銨溶液和釩酸銨溶液各50ml，混合，在加入100ml稀硝酸，混合，儲(chǔ)存在暗處，該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．1．5 醋酸緩沖液（pH值為5.5）稱(chēng)取三水醋酸鈉30g和二水氯化鈣0.167g，溶解在約500ml蒸餾水中用冰醋酸調(diào)解pH值至5.5，定容至1000ml，保存期1周。
3．2．1．6 10％氯化鈣溶液稱(chēng)取100gCaCl2。•2H20，加蒸餾水溶解，定容至1000ml，室溫儲(chǔ)藏。
3．2．l．7 植酸溶液（底物）。稱(chēng)取1．4g植酸鈉，溶解在200ml醋酸緩沖液中，在常溫下用稀釋的冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5，定容至250ml（植酸鈉是無(wú)水的，Sigma公司生產(chǎn)，分子量為1104，最終植酸鈉的摩爾濃度為5.1mM），該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．1．8 磷酸儲(chǔ)備液稱(chēng)取682mgKH2PO4（經(jīng)105℃烘干至恒重）溶解在100ml醋酸緩沖液中。0℃－ 5℃保存。
3．2．1．9 10mM標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液精確吸取10ml磷酸儲(chǔ)備液，用醋酸緩沖液稀釋至50ml，制成10mM磷酸溶液。該試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用。
3．2．2樣品酶活的測(cè)定稱(chēng)取4g待測(cè)樣品，用小磨或研缽磨成細(xì)粉。加入50ml蒸餾水，再加 1.6ml10％氯化鈣溶液，攪拌溶解60min，使酶蛋白充分溶出。吸取10ml，用小型臺(tái)式離心5min轉(zhuǎn)速為3 000rpm），做4個(gè)平行樣。離心結(jié)束后各吸取1ml，分別加入到4支試管中（2支做酶活測(cè)定，另2支做空白）。同時(shí)再準(zhǔn)備4支試管，其中2支各加入1ml10mM的標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液，另 2支試管中各加入lml的醋酸緩沖液。酶樣液、標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液和緩沖液，均在t＝0時(shí)加入3ml植酸底物，37℃水溶，在t＝60min，各加人2ml反應(yīng)終止液，混合，測(cè)定各自的OD415?？瞻讟釉趖＝0時(shí)加入2ml反應(yīng)終止液，再加入3ml植酸底物，37℃恒溫水浴60min以后測(cè)定其OD415。
ΔOD415＝樣品OD415－空白OD415。
3．2．3 酶活計(jì)算
設(shè)：磷酸標(biāo)準(zhǔn)液ΔOD415為A，酶液ΔOD415為B。A＝標(biāo)準(zhǔn)磷酸液的OD415一醋酸緩沖液的OD415。B＝酶樣品OD415一酶空白液OD415。設(shè)：酶粉的重量為W，稀釋倍數(shù)為K，磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為P（單位：μmol／l）。酶粉中植酸酶的酶活（FYT／g）＝K×B×P/A×W×60植酸酶酶活定義：37℃，pH值為5．5條件下，每分鐘水解植酸鈉溶液釋放1微摩爾無(wú)機(jī)磷的酶量為l個(gè)酶活單位，簡(jiǎn)稱(chēng)為 1FYT。
3．2．4 注意事項(xiàng)
3．2．4．1 釩酸是有毒的。其小鼠試驗(yàn)的半致死量LD50=18mg/kg.鉬釩終止液中釩酸的濃度為0．6mg/ml，最終的比色溶液中約含有釩酸0．24mg／ml。
3．2．4．2 OD415最大不應(yīng)超過(guò)0．8，若超過(guò)應(yīng)作適當(dāng)稀釋。
3．2．4．3上述測(cè)定方法適用于樣品中酶活＞50FYT／kg.
4 討論
    日前飼料行業(yè)對(duì)飼用酶制劑的生產(chǎn)還比較陌生，酶活的定義和測(cè)定方法至今還沒(méi)有統(tǒng)一.不同的生產(chǎn)廠家采用的標(biāo)準(zhǔn)和定義往往各不相同，許多產(chǎn)品說(shuō)明也缺乏科學(xué)依據(jù)。事實(shí)上，飼用酶制劑的研究與應(yīng)用在國(guó)外也剛開(kāi)始，許多研究工作還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和深入。不同的日糧，需要不同的酶種。不同的動(dòng)物、不同的生長(zhǎng)期，飼用酶的添加量也不同.另外，飼用酶需要有較好的熱穩(wěn)定性，而這一點(diǎn)往往不為酶的生產(chǎn)者所重視。產(chǎn)酶菌種的選育關(guān)心的上要是酶的活力和產(chǎn)量。本文介紹的一些常用飼用酶制劑的測(cè)定方法也僅分析了在常溫下的酶活。有關(guān)酶的熱穩(wěn)定性，特別是在飼料高溫制粒過(guò)程中酶的活力損失需另行探討。
作者: 韓冰    時(shí)間: 2007-11-12 20:02
好資料，并且是免費(fèi)的，頂。
作者: 米米拉撒    時(shí)間: 2007-11-13 00:02
挺好的資料，不過(guò)有沒(méi)有植酸酶的這方面的資料啊
作者: 微塵    時(shí)間: 2007-11-13 17:48
復(fù)合酶制劑的單酶要是有國(guó)標(biāo)，這個(gè)市場(chǎng)就不會(huì)太亂了



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