枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕營養(yǎng)特性的研究

IMCTT 2018-5-22 09:53

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簡介

隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)和飼料工業(yè)的發(fā)展，一些常規(guī)飼料，尤其是蛋白質(zhì)飼料嚴重缺乏，越來越滿足不了生產(chǎn)的需要。

　　導(dǎo)讀

　　隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)和飼料工業(yè)的發(fā)展，一些常規(guī)飼料，尤其是蛋白質(zhì)飼料嚴重缺乏，越來越滿足不了生產(chǎn)的需要。尋求非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料對我國畜牧業(yè)的發(fā)展起著非常重要的作用。而我國是產(chǎn)棉大國，棉籽產(chǎn)量居世界首位，而且棉籽經(jīng)過加工榨油后的副產(chǎn)物棉籽餅粕是很好的蛋白質(zhì)飼料。但是普通的棉籽餅粕具有抗營養(yǎng)因子和棉酚，使得棉籽餅粕不能大量使用。枯草芽孢桿菌生長速度快，營養(yǎng)需求簡單，易于存活、定殖和繁殖，并且分泌多種酶和維生素，具有良好的發(fā)酵作用，因此利用微生物對棉粕進行生物發(fā)酵，消除抗營養(yǎng)因子，降低棉酚含量，提高棉粕的消化利用率具有重要意義。鮑振國等(2013)及和小黑等(2014)通過研究枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和熱帶假絲酵母發(fā)酵棉粕，發(fā)現(xiàn)棉粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后均能不同程度地分泌各種酶類，降解粗纖維，提高粗蛋白含量，而且將蛋白降解為易于機體吸收的小肽，并能降解抗營養(yǎng)因子植酸等。因此試驗擬通過枯草芽孢桿菌對棉粕進行發(fā)酵，探究其發(fā)酵前后棉酚、常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)、小肽和氨基酸的含量的變化，為發(fā)酵棉粕的營養(yǎng)價值評定提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1 試驗樣品
　　發(fā)酵底料由90%的棉粕和10%的玉米組成，采用枯草芽孢桿菌菌種為Z3，由新疆石河子大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室選育。

　　1.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
　　蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5和瓊脂15g/L，pH 7.0，121℃條件下高壓15min。

　　1.3 種子液培養(yǎng)
　　將枯草芽孢桿菌Z3挑取1環(huán)菌苔接入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后接入20mL(50mL三角瓶)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，200r/min搖動培養(yǎng)15h(一級菌種)，取一級菌種1mL接入50mL(150mL三角瓶)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃，200r/min搖動培養(yǎng)15h(二級菌種)。

　　1.4 試驗方法
　　1.4.1 發(fā)酵底物處理
　　試驗組底物處理:將棉粕90和玉米粉l0g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌，在0.056MPa，121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后于無菌條件下接入枯草芽抱桿菌Z3二級種子液7mL，攪拌均勻，三角瓶4層紗布封口，于恒溫培養(yǎng)箱37℃靜止培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵產(chǎn)物放入烘箱中45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　對照組底物處理:將棉粕90和玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均勻，然后加入蒸餾水30mL，充分攪拌調(diào)濕，在0.056MPa，121℃條件下蒸汽滅菌20min，冷卻后接入液體培養(yǎng)基(不含菌種)7mL，攪拌均勻，不經(jīng)發(fā)酵，直接將其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷卻粉碎，過60目篩，裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

　　1.4.2 棉酚含量的測定
　　總棉酚(TG)采用ISO6866—1985方法測定，游離棉酚(FG)采用GB13086—1991方法測定，結(jié)合棉酚(BG)按照BG=TG－FG計算得出。游離棉酚脫毒率/%=(發(fā)酵前底物FG單位含量－發(fā)酵后底物FG校正含量)÷發(fā)酵前底物FG單位含量×100。常規(guī)營養(yǎng)指標的測定采用國標法(GB6435)。

　　1.4.3 小肽含量的測定
　　分別稱取樣品1g溶于8mL蒸溜水，在25℃空氣浴搖床振蕩提取2h，混合液離心4000r/min20min，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，4℃保存待測，采用高效液相色譜進行分析。色譜柱:型號TSKgelG2000SWXL，8mm×300min凝膠柱。流動相(體積比)∶水∶三氟乙酸為100%∶0.1%。檢測波長:220nm。流速:1.0mL/min，柱溫:30℃，進樣體積:20μL。

　　以Gly－Leu(相對分子質(zhì)量188u)、還原型谷耽甘肽(GSH，相對分子質(zhì)量307u)、氧化型谷胱甘肽(GSSG，相對分子質(zhì)量613u)和桿菌肽(相對分子質(zhì)量1423u)作為相對分子質(zhì)量標準建立保留時間與分子量的線性方程，經(jīng)計算確定600、1000和1800u相對分子質(zhì)量的保留時間。將樣品在以上色譜條件下分析，選擇這段時間內(nèi)的峰，積分求得峰面積，相對分子質(zhì)量大的先出峰，相對分子質(zhì)量小的后出峰。

　　1.4.4 氨基酸含量的測定
　　樣品粉末用甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶1)充分提取，提取質(zhì)量濃度為40mg/mL，提取液過0.45μm水系濾膜，濾液進行氨基酸前處理操作。

　　取10μL稀釋液，置于試管內(nèi)，加100μL日常工作液，渦旋混勻，高速離心。上清液轉(zhuǎn)入另一試管，氮吹。加入60μL衍生工作液，渦旋混勻，旋轉(zhuǎn)離心。65℃溫育15min，然后離心氮吹。加入100μL乙腈水混合液復(fù)溶，渦旋混勻，旋轉(zhuǎn)離心。使用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀檢測樣本。

　　液相和質(zhì)譜儀器型號:液相型號，HPLC Ultimate3000;質(zhì)譜型號，3200 Q TRAPLC－MS/MS;色譜柱，AAA C 18，5μm，150mm×4.6mm，柱溫50℃，進樣量10μL;流動相A，水+0.1%甲酸;流動相B，乙腈+0.1%甲酸;CUR，20.00;CAD，Me－dium;CXP，5.00;IS，5500.00;DP，35.0;GS1，55.00;TEM，580.00;EP，10.0;GS2，60.00。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對棉酚含量的影響

　　從表2可見:底物滅菌對照組相對于底物不滅菌對照組總棉酚、游離棉酚和結(jié)合棉酚含量顯著降低(P＜0.05)，分別降低2146.67、536.83和1609.84mg/kg。發(fā)酵組和底物滅菌對照組相比，其總棉酚、游離棉酚和結(jié)合棉酚含量顯著降低(P＜0.05)，分別降低531.67、101.00和430.66mg/kg。棉粕底物經(jīng)過滅菌后脫毒率為74.77%，而經(jīng)過滅菌后再發(fā)酵，脫毒率進一步顯著提高，脫毒率為88.84%，由以上分析可以得出，底物經(jīng)過滅菌和滅菌后發(fā)酵可以使大部分游離棉酚降解消除，部分結(jié)合棉酚和總棉酚也被降解。

　　2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

　　從表3可見:底物不滅菌對照組、底物滅菌對照組和發(fā)酵組3組間的干物質(zhì)差異不顯著(P＞0.05);底物滅菌對照組和底物不滅菌對照組相比，粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)、鈣、磷和粗灰分含量差異不顯著(P＞0.05);發(fā)酵組與底物不滅菌對照組和底物滅菌對照組相比，粗蛋白含量顯著增加(P＜0.05)，蛋白含量分別增加14.37%和13.79%，粗脂肪、ADF和NDF含量顯著降低(P＜0.05)，磷和鈣含量顯著增加(P＜0.05)。底物經(jīng)過滅菌后其常規(guī)營養(yǎng)成分含量基本不變，但是經(jīng)過發(fā)酵后，其常規(guī)營養(yǎng)成分含量會有所變化，其中粗蛋白含量增加0.51%，其余常規(guī)營養(yǎng)成分含量下降。

　　2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對小肽含量的影響

　　從表4可見:底物不滅菌對照組和底物滅菌對照組小肽含量差異不顯著(P＞0.05);發(fā)酵組棉粕中的小肽含量均高于未發(fā)酵的棉粕，且差異顯著(P＜0.05)，其中小于600、600～1000和1000～1800u的小肽含量分別提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高壓對小肽含量的產(chǎn)生影響不大，而經(jīng)過發(fā)酵后小肽含量會明顯的增加。

　　3討論

　　利用微生物發(fā)酵棉粕，不僅可以降低棉粕中的棉酚含量，還可以提高棉粕的營養(yǎng)價值，改善棉粕源飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)，同時可以產(chǎn)生多種消化酶使大分子物質(zhì)分解為小肽物質(zhì)及提高發(fā)酵產(chǎn)物的菌群數(shù)量，對提高棉粕源飼料的綜合利用價值具有重要意義。

　　3.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對底物中棉酚含量和常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)的影響

　　試驗底物經(jīng)過滅菌和滅菌后發(fā)酵都可以降低棉粕中棉酚的含量，說明高壓滅菌可以破壞棉酚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分棉酚結(jié)構(gòu)不完整，從而起到使棉酚含量降低的作用。高壓滅菌的底物經(jīng)過發(fā)酵后，可以顯著的降低棉酚的含量，說明通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵，能夠達到降低棉粕棉酚含量的目的，這與賈曉鋒等(2009)和魏二虹等(2010)利用生物發(fā)酵的研究結(jié)果相一致。張慶華等(2007)采用熱帶假絲酵母、擬內(nèi)胞霉和植物乳桿菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵棉粕，顯著的提高棉粕脫毒率和粗蛋白含量。吳偉偉等(2010)用黑曲霉與釀酒酵母混合固態(tài)發(fā)酵棉籽餅粕得到了同樣的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵后，其蛋白水平會有一定的提高，可能主要與微生物的生長及菌體蛋白含量的增加和微生物發(fā)酵過程中分泌的酶含量的增加有關(guān)。同時枯草芽孢桿菌利用底物中的非蛋白氮將其轉(zhuǎn)化為菌體蛋白或分泌蛋白，使發(fā)酵后蛋白含量提高。研究發(fā)現(xiàn)，使用熱帶假絲酵母和黑曲霉復(fù)合發(fā)酵棉粕顯著提高粗蛋白含量的同時提高棉粕鈣和磷的含量，降低粗脂肪、粗纖維和粗灰分含量，這與研究的結(jié)果一致。這主要是由于微生物生長代謝過程中，氧化消耗能量，使能量物質(zhì)減少，因此鈣和磷在干物質(zhì)中的比例就相對提高，而且微生物能夠利用并且分解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，將其轉(zhuǎn)化為寡糖，使粗纖維含量降低。

　　3.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對底物中小肽和氨基酸含量的影響

　　研究利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕底物，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過發(fā)酵后小肽的含量和氨基酸的含量顯著提高，許多研究表明微生物發(fā)酵可將底物中蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白和氨基酸等，顯著提高飼料中氨基酸的含量。使用熱帶假絲酵母JD－9和干酪乳桿菌MX－48發(fā)酵棉粕，發(fā)酵后棉粕中小肽含量顯著的提高?？赡苁抢梦⑸锇l(fā)酵使得很多難利用的大分子物質(zhì)被降解，產(chǎn)生了很多易于被吸收的小分子物質(zhì)、小肽類物質(zhì)和游離氨基酸，顯著提高飼料的營養(yǎng)價值。

　　4結(jié) 論

　　枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕能很大程度的降低游離棉酚的含量，降低率達到88.84%。同時經(jīng)過發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量顯著提高5.2%，顯著的降低粗脂肪和粗纖維的含量。增加底物中肽類物質(zhì)的含量，相對分子質(zhì)量小于600、600～1000和1000～1800u小肽含量分別提高12.4%、1.45%和1.793%，而且必需氨基酸蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸分別提高8.45%、6.25%、24.1%、3.5%、12.3%和9.52%。

　　注：本文由生物飼料開發(fā)國家工程研究中心（BFC）小編整理發(fā)布，如有任何建議或意見及投稿等，請您加小編微信（13260429991）交流互動。

　　參考文獻略
　　責(zé)編：馬維軍；審閱：陳達博士
　　來源：飼料研究；作者：孫煥林，孫新文，李洪，張文舉